猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和沙门氏菌混合感染病例的诊断

彭 涛 ，汪晓飞 ，古金元 ，胡东方，陈同煜 ，王玉超 ，刘思当*

（1．山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271000；2．山东省畜牧业贸易服务中心，山东 济南 250300）

猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和沙门氏菌混合感染病例的诊断

彭 涛1，汪晓飞2，古金元1，胡东方1，陈同煜1，王玉超1，刘思当1*

（1．山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271000；2．山东省畜牧业贸易服务中心，山东 济南 250300）

近年来，随着猪场养殖规模的不断扩大，加上猪群频繁的调入转出，猪群发病的动态也越来越复杂。猪群发病是由多种致病因素作用的结果，往往由两种或两种以上的病原混合感染所造成。常常是多种病毒和细菌混合感染或者是继发感染，导致发病率和死亡率急剧升高，危害加大，使疾病的预防和控制难度增大，造成严重的经济损失。本文对某发病猪场病死仔猪进行了剖检诊断、病理组织学观察及实验室病原检测，确诊其为猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和沙门氏菌混合感染。

猪伪狂犬病毒；猪圆环病毒2型；沙门氏菌；混合感染

猪伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒（PCV）均是对养猪业造成危害最为严重的病毒之一，猪伪狂犬病毒主要引起公猪不育；妊娠母猪流产、死胎；新生仔猪大量死亡；育肥猪呼吸困难、生长停滞等，并且严重侵害脑部神经，造成猪群共济失调，四肢抽搐等神经症状。猪圆环病毒国内有两个血清型，即PCV1和PCV2，现如今国外有报道称已发现PCV3，但在国内还尚未发现。其中PCV1为非致病性病毒，PCV2为猪群主要致病性病毒，导致断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）和皮炎与肾病综合征（PNDS）等多种病症。猪圆环病毒2型主要引起猪只皮肤苍白、被毛蓬乱；呼吸困难；体表浅淋巴结肿大，特别是腹股沟浅淋巴结肿大；猪群渐进性消瘦或生长迟缓；体表皮肤发生充血出血斑。猪沙门氏菌临床常见慢性型感染，沙门氏菌感染病猪主要表现为体温升高，精神沉郁；咳嗽；寒颤；眼结膜有黏性和脓性分泌物；先便秘后腹泻，粪便恶臭，呈淡黄色或灰绿色，混有血液、纤维碎片或者坏死组织。

1 发病背景

2017年3月，山东省泰安地区某猪场300多头保育仔猪中，50%的仔猪发病，其中发病致死率为70%左右。仔猪为外地购买，畜主未知其之前免疫程序，购买后猪场仅免疫猪瘟疫苗。

2 临床症状和剖检变化

2.1 临床症状

病猪主要表现为体温升高，精神沉郁；被毛粗乱，消瘦，脊柱突出；怕冷，卷曲成团；皮肤见痂状湿疹；眼角有脓性分泌物，肛门粘有黄色稀粪。

2.2 剖检病变

病猪心包积液；肺脏暗红色硬实；胃底及幽门部位出血、溃疡；肝脏表面有黄白色针尖大坏死灶；脾脏暗红色肿胀，坚硬如橡皮，表面有纤维素性渗出物；盲肠弥漫性出血（见图1）。

图1 病猪剖检病理变化

3 组织病理学观察

剖检时取肝、肺、脾、肠等器官病料10%福尔马林溶液固定，常规石蜡切片、HE染色法，光镜下观察组织病理变化（见图2）。

图2 组织病理切片

肝脏见许多坏死灶，为典型副伤寒结节病变，结节内肝细胞变性、坏死，许多巨噬细胞浸润增生；肺泡壁增厚，巨噬细胞、淋巴细胞浸润增生，毛细血管充血、出血，肺泡腔内充满炎性渗出物；脾脏弥漫性出血，白髓消失；肠绒毛上皮细胞坏死脱落，黏膜下层充血、出血。

4 病原学检查

4.1 DNA/RNA提取

将冻存的淋巴结、脾、肺、肾、肠道等组织，各取豆粒大置于灭菌的匀浆器中，加入1 mL冰浴的灭菌PBS，研磨至组织液黏稠无明显颗粒时，将匀浆物转移至灭菌1.5 mL离心管中。而后置于-20℃冰箱中进行反复冷冻3次后，将匀浆液9 000 r/min离心3 min后将上清吸入新的灭菌离心管内备用。

病料中病毒DNA或RNA的提取采用北京全式金 Easy Pure Viral DNA/RNA Extraction kit，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

4.2 RT-PCR检测

用提取的DNA/RNA，分别对猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒进行RT-PCR/PCR扩增检测。检测结果显示，该病料中含有猪伪狂犬病毒和2型猪圆环病毒，其他病毒未检出（见图3）。

图3 琼脂糖凝胶电泳图

5 细菌分离培养及鉴定

5.1 病料触片染色镜检

无菌取病猪病变明显的淋巴结、肺脏、脾脏，用载玻片制成组织触片，进行革兰氏染色，然后显微镜下观察。镜检（见图4）见大量革兰氏阴性、两端钝圆、中等大小的杆菌。

图4 粉红色两端钝圆中等大小的直杆菌

5.2 细菌分离和培养

用接种环无菌取病变明显的淋巴结、肺脏、脾脏，分别划线接种于SS 琼脂培养基上，37 ℃培养 16～24 h，观察结果(见图 5）。

图5 SS琼脂鉴别培养基

得到的菌落在 SS 琼脂平板上呈黑色菌落，因为沙门氏菌能产生H2S，与SS培养基成分中柠檬酸铁反应生成黑色物质。挑取SS培养基上的单个菌落进行染色镜检，镜检结果与病料组织触片观察相一致。

5.3 PCR/PT-PCR鉴定

根据GenBank公布的序列设计猪副伤寒沙门氏菌的特异性引物（见表1），用PCR/PT-PCR扩增后进行凝胶电泳成像（见图6）。

表1 引物序列

图6 琼脂糖凝胶电泳图

5.4 生化鉴定

从培养基上挑取单个菌落接种于LB液体培养基，置37 ℃、250 r/min摇床内培养12 h后，分别接种于葡萄糖、甘露醇、核糖、尿素、ONPC、枸橼酸盐、氧化酶，37 ℃培养48～72 h；同时接种VP管、MR和吲哚生化管，37 ℃振荡培养48 h，然后按VP试验、MR试验、吲哚试验方法分别加入相应试剂，观察试验结果（见表2）。

表2 生化实验检测结果

根据分离菌形态，培养特性、菌液PCR/PT-PCR诊断和生化鉴定结果，判定该分离菌为猪副伤寒沙门氏菌。

5.6 药物敏感试验

药敏试验按常规方法取0.5 mL的菌液涂布于伊红美兰平板，然后分别将庆大霉素、链霉素、四环素、恩诺沙星和头孢噻呋药敏片置于该平板上，贴放后用镊子轻压。37 ℃培养16～24 h，观察结果。结果发现对恩诺沙星、头孢噻呋高度敏感，对链霉素低度敏感。

6 结论

据临床症状、剖检病变、病理组织学观察及实验室病原学检测，该病例被确诊为猪伪狂犬病毒、2型猪圆环病毒和沙门氏菌混合感染。

7 综合防治措施

7.1 病猪隔离

发现病猪后立即进行隔离，避免交互感染，对发病严重并且没有治疗价值的猪只进行淘汰扑杀，尸体无害化处理。

7.2 猪场卫生消毒

对发病猪舍进行彻底地消毒处理，特别是猪舍内残留的饲料、饮水及时清理，对料槽和饮水器等器具加强消毒，猪舍内空气进行喷洒消毒。

7.3 细菌性疾病防治

猪副伤寒沙门氏菌主要发生于密集饲养的猪群，感染原因一方面是由于病猪及带菌猪污染了饲料、饮水及土壤等，健康猪接触后感染。另一方面是健康猪体内本身存在沙门氏菌，但由于抵抗力强，未表现出发病症状，由于饲养管理不当、气候突变、有其他传染病尤其是免疫抑制性病毒病等诱因，导致猪只体质减弱，抵抗力下降，病原菌随即大量繁殖，毒力增强而致病。可用包被恩诺沙星拌料饲喂发病猪群，病猪头孢噻呋钠注射进行治疗。并且要注意平时的药物保健，采用合理药物保健程序，即可预防多种细菌性疾病的感染。

7.4 病毒性疾病防治

病毒性疾病关键在于预防，大部分病毒性疾病一旦发生，无特效治疗药物。预防病毒性疾病的重要手段就是进行疫苗免疫。首先要选取高效疫苗，其次要制定科学合理的免疫程序，并加强常见病毒病的免疫监测。

本研究由国家重点研发计划项目“猪重要疫病免疫防控新技术研究”子课题“规模化猪场科学合理的免疫程序的研究（2017YFD0500605）”支持。

彭涛（1995-），男，山东淄博人，硕士，主要从事动物临床病理学研究 .E-mail：244764302@qq.com

*通讯作者简介：刘思当，山东省农业大学教授，博士生导师.E-mail：liusidang@126.com

2017-06-01）