降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞FoxO1表达的影响

莫芳芳 刘海霞 华 静 赵丹丹 田 甜 高思华

(1 北京中医药大学，北京，100029； 2 北京中医药大学第三附属医院，北京，100029)

实验研究

降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞FoxO1表达的影响

莫芳芳1刘海霞1华 静2赵丹丹1田 甜1高思华1

(1 北京中医药大学，北京，100029； 2 北京中医药大学第三附属医院，北京，100029)

目的：通过研究降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞FoxO1因子表达的影响，探讨降糖消渴颗粒含药血清保护胰岛β细胞的分子机制。方法：通过慢病毒转染的方法制备FoxO1高表达INS-1稳定细胞株，以2.5 μg/mL四环素干预12 h诱导FoxO1高表达以成模。以10%的降糖消渴颗粒含药血清干预细胞模型24 h，正常鼠血清作对照。高倍镜下观察细胞形态，MTT法计算细胞存活率，全自动生化仪检测细胞培养液中葡萄糖含量以计算葡萄糖消耗量，Elisa法检测细胞胰岛素分泌量，Western blot检测细胞中FoxO1总蛋白表达水平及其磷酸化水平，以qRT-PCR检测FoxO1mRNA表达情况。结果：高倍镜下观察细胞形态、细胞存活率均无统计学意义。降糖消渴颗粒含药血清组葡萄糖消耗量与细胞胰岛素分泌量均显著升高(P<0.01)。Western-blot结果显示FoxO1总蛋白表达无统计学意义(P>0.05)，而p-FoxO1蛋白表达增加(P<0.05)。qRT-PCR结果显示FoxO1mRNA表达量稍有降低，但差异没有统计学意义(P>0.05)。结论：降糖消渴颗粒含药血清不能降低INS-1细胞FoxO1蛋白表达水平，但能促进FoxO1磷酸化，进而达到改善胰岛β细胞功能的作用。

降糖消渴颗粒；FoxO1；INS-1细胞；2型糖尿病

Forkhead(Fox)因子是一类蛋白质家族，其在生物体内起着重要作用，已经成为生命科学研究的热点之一[1]。目前发现Fox有17个亚族，FoxO是其中之一。FoxO主要通过转录调控和信号传导途径来调节动物的生长发育、细胞分化、代谢、凋亡、炎性反应和免疫等[2]。FoxO1是FoxO家族中发现最早的成员，它能促进脂肪细胞的分化[3-4]、负调控骨骼肌的生成和Ⅰ型肌纤维基因的表达[5]，且对肝细胞、胰岛β细胞及脂肪细胞中胰岛素作用的发挥起重要作用[6]。《CELL》发表的研究结果表明FoxO1与胰岛β细胞去分化相关，是维持β细胞身份的最主要作用因子[7]。

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)是一种复杂的遗传因素和环境因素共同作用所致的内分泌代谢性疾病。胰岛β细胞数目减少及功能受损是T2DM发生发展的最重要病理生理基础之一。降糖消渴颗粒是在导师肝脾肾同调辨治糖尿病大法指导下所组方剂，其临床疗效确切[8]。实验研究也已经证实降糖消渴颗粒含药血清可抑制大鼠胰岛β细胞瘤株INS-1凋亡[9]。为进一步研究降糖消渴颗粒治疗T2DM的作用机制，本研究拟从FoxO1切入，通过体外培养INS-1细胞，慢病毒转染制备FoxO1高表达模型，再以降糖消渴颗粒含药血清干预，探讨其对β细胞FoxO1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性8周龄SD大鼠30只，体重(300±20)g，购自北京维通利华实验动物中心(合格证号：SCXK(京)2012-0001)。INS-1细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院细胞资源中心。

1.1.2 药物 降糖消渴颗粒的成药颗粒剂型由北京中医药大学中药学院中药科技发展部生产及提供，已经过质量鉴定，每克颗粒含5.01 g生药，药物样品均保存于北京中医药大学糖尿病研究中心实验室内(4 ℃保存)，以备未来参考。临用时用蒸馏水配成相应浓度的混悬液[10]。

1.1.3 试剂与仪器 RPMI-1640培养基，购自INVITROGEN公司；胰蛋白酶，购自SOLARBIO公司；胎牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司；青/链霉素，购自HYCLONE公司；RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自北京普利莱基因技术有限公司；MTT购自Sigma公司；大鼠胰岛素(INS)ELISA kit，购自武汉华美生物工程有限公司；FoxO1(C29H4)Rabbit mAb购自CST公司；Anti-FOXO1A(phospho S256)antibody购自ABCAM公司，RNeasy Mini Kit，购自QIAGEN公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，购自FERMENTAS公司；FG，POWER SYBR GREEN PCR，购自INVITROGEN公司；PCR引物购自上海生工生物工程有限公司。CO2培养箱、荧光定量PCR仪：美国Thermo公司；超净台工作：香港Heal Force公司；酶标仪：瑞士Tecan全波长多功能酶标仪；显微镜、AU400全自动生化分析仪：日本OLYMPUS公司；电泳和转膜装置、XRS凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备方法 雄性8周龄SD大鼠30只，体重(300±20)g，按体质量随机分组如下：空白对照组10只，降糖消渴颗粒组20只，给药剂量为52.8 g生药/(kg体重·d)(相当于临床人公斤体质量用量的60倍)进行灌胃，每天上、下午各灌胃1次，共5次。空白对照组只灌胃等量的蒸馏水。末次灌胃后1 h，乙醚麻醉大鼠，无菌条件下经腹主动脉取血，4 ℃静置1 h，3 000 r/min离心20 min，分离含药血清。合并同组大鼠含药血清，56 ℃水浴30 min灭活，微孔滤膜过滤除菌，冻存管分装，-80 ℃保存备用[11]。

1.2.2 INS-1细胞培养 INS-1细胞以含10%胎牛血清(FBS)，100 IU/mL青霉素，100 IU/mL链霉素，50 μmol/Lβ-巯基乙醇的RPMI-1640完全培养基置于37 ℃，5% CO2条件下无菌培养24 h更换培养基一次，待细胞密度达到70%～80%后进行细胞传代。

1.2.3 INS-1细胞FoxO1高表达模型的建立及鉴定 构建含有FoxO1基因片段的质粒载体，应用慢病毒转染的方法将其转入INS-1细胞，经puromycin筛选获得稳定表达FoxO1细胞株(OE)和阴性对照细胞株(NC)，2.5 μg/mL Doxycycline干预12 h诱导FoxO1表达。用qRT-PCR检测NC、OE 2种细胞株FoxO1基因的表达情况，以对模型进行鉴定。

图1 FoxO1相对基因的表达

注：与NC组比较，**P<0.01

OE组FoxO1基因的表达丰度是NC组的2.05倍，NC组相对RNA水平是(1.003±0.089)，OE是(2.050±0.213)，有明显的统计学意义，说明FoxO1基因转染成功，模型建立成功。

1.2.4 药物干预及指标检测 以10%的降糖消渴颗粒含药血清[9]干预细胞模型24 h，正常鼠血清作对照。分别检测正常组、模型组、药物组细胞培养液中的葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量，MTT法检测吸光度，计算细胞存活率，Elisa法检测细胞胰岛素分泌量，Western blot检测细胞中FoxO1总蛋白表达水平及其磷酸化水平，以qRT-PCR检测FoxO1mRNA表达情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据处理分析，每组实验重复3次，数据均以Mean±SE表示，2组比较采用t检验，多组组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态观察 在高倍镜下观察，正常组、模型组和降糖消渴颗粒组的细胞呈梭形或多边形，细胞核明显，细胞形态基本相似(如图2)。结果显示，慢病毒转染造模和10%降糖消渴颗粒含药血清干预细胞均不会造成细胞形态的变化。

图2 细胞形态(200×)

2.2 降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞葡萄糖消耗量及细胞存活率的影响 检测细胞培养液中葡萄糖含量，与未接种细胞的空白复孔的葡萄糖浓度相减，算出各孔的葡萄糖消耗量。结果如图3所示，与正常对照组比较，模型组的细胞葡萄糖消耗量明显减少(*P<0.01)，差异有统计学意义。与模型对照组比较，10%降糖消渴颗粒含药血清能够增加FoxO1高表达INS-1细胞模型的葡萄糖消耗量(**P<0.01)。

MTT法测定波长在570 nm各孔的吸光度,计算细胞存活率。如图3所示，各组之间细胞存活率无显著性差异(#P>0.05，##P>0.05)，说明慢病毒转染制备FoxO1高表达模型与10%降糖消渴颗粒含药血清干预细胞均未见明显细胞毒性。

2.3 降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞胰岛素分泌功能的影响 如图4所示，与正常组比较，INS-1细胞FoxO1高表达模型组的细胞胰岛素分泌量减少，差异有统计学意义(*P<0.01)，提示FoxO1高表达INS-1细胞胰岛素分泌功能受损。与模型组比较，10%降糖消渴颗粒含药血清能够明显增加细胞胰岛素分泌量(**P<0.01)。

图3 降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞葡萄糖消耗量及细胞存活率的影响

注：与正常组比较，*P<0.01，#P>0.05，与模型组比较，**P<0.01，##P>0.05

图4 降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞胰岛素分泌功能的影响

注：与正常组比较，*P<0.01，与模型组比较，**P<0.01

2.4 降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞FoxO1蛋白表达及其磷酸化水平的影响 如图5所示，Western-blot结果显示，与正常INS-1细胞比较，FoxO1高表达细胞模型组FoxO1总蛋白表达增加(#P<0.01)，p-FoxO1蛋白表达无统计学意义(*P>0.05)，提示模型稳定。应用10%降糖消渴颗粒含药血清干预24 h后，与模型对照组比较，FoxO1总蛋白表达无统计学意义(##P>0.05)，而p-FoxO1蛋白表达增加(**P<0.05)。

图5 降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞FoxO1、P-FoxO1蛋白表达的影响

注：与正常组比较，*P>0.05，#P<0.01，与模型组比较，**P<0.05，##P>0.05

2.5 降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞FoxO1 mRNA表达的影响 如图6所示，qRT-PCR结果显示，与正常组比较，模型对照组FoxO1mRNA表达量明显升高(*P<0.01)，提示细胞模型稳定。以10%降糖消渴颗粒含药血清干预FoxO1高表达INS-1细胞模型24 h，与模型对照组比较，FoxO1基因表达量稍有降低，但差异没有统计学意义(**P>0.05)。

图6 降糖消渴颗粒含药血清对INS-1细胞FoxO1 mRNA表达的影响

注：与正常组比较，*P<0.01，与模型组比较，**P>0.05

3 讨论

胰岛素抵抗和胰岛β细胞受损是T2DM发病的重要病理机制，尤其β细胞数量减少和功能受损在T2MD发生和发展中发挥了重要作用。大量研究资料表明，FoxO1在胰岛β细胞中表达丰富，FoxO1作用于协调β细胞的更新和功能之间的关系，是胰岛β细胞应激、增殖、凋亡调控网络的关键点[12-17]。

FoxO1的活性受胰岛素的负性调节。FoxO1作为胰岛素/胰岛素样生长因子1(INS/IGF-1)信号通路中的关键因子，其上游受磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)磷酸化级联通路的调节。FoxO1分子中有三个保守的AKT/PKB蛋白激酶的磷酸化位点，PI3K/AKT途径被激活后，使细胞核中的FoxO1磷酸化而发生核输出，由核内转至胞质中，失去转录活性，从而抑制细胞的凋亡。当胰岛素信号减弱时，通过PI3K/AKT通路，AKT/PKB蛋白激酶活性降低，使FoxO1磷酸化水平降低而滞留在细胞核内，失去活性，进而通过诱导靶基因表达而导致细胞功能的改变[18]。

在我们的研究中发现FoxO1高表达的INS-1细胞的葡萄糖消耗量和胰岛素分泌量均有所降低，提示FoxO1高表达导致了INS-1细胞分泌胰岛素的功能受损。降糖消渴颗粒含药血清能够增加胰岛β细胞的葡萄糖消耗量和胰岛素分泌量，从而改善了细胞功能。进一步研究分子机制，FoxO1高表达INS-1细胞中总的FoxO1蛋白水平和mRNA均显著增加，说明慢病毒转染的细胞模型稳定。经降糖消渴颗粒含药血清干预，细胞中总的FoxO1蛋白水平和mRNA含量均无显著性变化，而P-FoxO1蛋白水平增加，说明降糖消渴颗粒含药血清促进了β细胞中FoxO1磷酸化出核，可能激活PI3K/AKT途径，从而改善细胞胰岛素分泌功能。这可能是降糖消渴颗粒含药血清保护胰岛β细胞、改善细胞功能的作用机制之一。

综上所述，FoxO1因子在β细胞中发挥着重要作用，本研究表明了降糖消渴颗粒不能降低FoxO1蛋白水平，但能促进FoxO1磷酸化，进而改善β细胞的胰岛素分泌功能，然而降糖消渴颗粒是否通过激活PI3K/AKT通路而发挥作用，还需进一步实验证实。

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EffectsofJiangtangXiaokeGranuleContainedSerumonFoxO1ExpressioninINS-1Cell

Mo Fangfang1, Liu Haixia1, Hua Jing2, Zhao Dandan1, Tian Tian1, Gao Sihua1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicineThirdAffiliatedHospital,Beijing100029,China)

Objective:To study the molecular mechanism of Jiangtang Xiaoke Granule contained serum in protecting β-cells through studying the effects of Jiangtang Xiaoke Granule (JTXK) contained serum on FoxO1 expression in INS-1 cell.MethodsLentivirus transfection was used to prepare FoxO1-overexpressing INS-1 stable cell line, and the overexpression was induced by 2.5 μg/mL doxycycline for 12 hours. The cells were treated with 10% JTXK granule containing serum for 24 h. And normal rat serum was used as control. The morphological changes of cells were observed under high power microscope. MTT analysis was used to calculate cell viability. The glucose concentration in cell culture was detected by automatic biochemical analyzer. And the glucose consumption was calculated. ELISA analysis was used to examine insulin secretion. The expression levels of FoxO1 and P-FoxO1 were evaluated by western blot. And the expression levels of FoxO1mRNA were evaluated by quantitative real-time PCR (qRT-PCR).ResultsThe cells did not have significant differences in size and shape. And there was no difference in cell viability among three groups. The glucose consumption and insulin secretion were increased in JTXK group (P<0.01). At the same time, the results of western-blot and qRT-PCR showed that the expression of FoxO1 and FoxO1mRNA had no difference (P>0.05). However, the expression of P-FoxO1 was increased (P<0.05).ConclusionJTXK granule cannot decrease the expression of FoxO1 of INS-1 cell, but can promote phosphorylation of FoxO1, so as to improve β-cell function.

Jiangtang Xiaoke (JTXK) granule, FoxO1, INS-1 cell, Type 2 diabetes mellitus (T2DM)

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.12.047

北京中医药大学中青年教师自主选题项目(2015-JYB-JSMS015)

莫芳芳(1982.03—)，女，博士，助理研究员，研究方向：脏腑相关理论研究与中医药防治糖尿病研究，E-mail：xiaofang.tcm@163.com

高思华(1957.07—)，男，博士，教授，研究方向：运气学说、脏腑相关理论研究与中医药防治糖尿病研究，Tel：(010)64286915，E-mail：sihuagaopaper@sina.com

(2017-07-21收稿 责任编辑：徐颖)