基于拉曼光谱法测定冷鲜牛肉中肌红蛋白相对含量

张同刚，罗瑞明，李亚蕾*，周亚玲

基于拉曼光谱法测定冷鲜牛肉中肌红蛋白相对含量

张同刚，罗瑞明，李亚蕾*，周亚玲

（宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

为研究4 ℃贮藏期间冷鲜牛肉3 种化学形式肌红蛋白相对含量变化，对采集的一维拉曼光谱，用2D-shige二维相关分析软件对其光谱数据进行二维相关分析，得出3 种化学形式肌红蛋白的相对含量最佳推导公式。结果表明：肌红蛋白、氧合肌红蛋白与高铁肌红蛋白相对含量的最佳推导公式分别为：脱氧肌红蛋白相对含量/%=（-0.305 5x＋19.570）×100；氧合肌红蛋白相对含量/%=（-2.933 9x＋154.17）×100；高铁肌红蛋白相对含量/%=（1.574 3x-14.369）×100。3 种化学形式的肌红蛋白相对含量的预测效果为高铁肌红蛋白＞脱氧肌红蛋白＞氧合肌红蛋白，其中波数为1 033～1 248 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量的误差值最小为4.76%。研究表明，基于拉曼光谱法无损检测冷鲜牛肉中肌红蛋白相对含量是可行的。

拉曼光谱；二维相关光谱技术；冷鲜牛肉；肌红蛋白

肉色是影响消费者对肉购买行为的决定性因素，因为肉的颜色被认为是评价肉及肉制品新鲜程度和品质特征的重要指标。牛肉色泽主要由血红蛋白与肌红蛋白决定，屠宰后放血充分的鲜肉中，肉的颜色主要是由肌红蛋白在肉中的含量和存在状态决定的。刚刚屠宰完的肉色呈现为暗红色（脱氧肌红蛋白），随后与氧气的接触，发生氧化反应，呈现为鲜红色（氧合肌红蛋白），随着冷鲜牛肉贮藏时间的延长，肉色发生褐变（高铁肌红蛋白）[1-4]。随着我国人民生活水平的提高，冷鲜肉正逐渐成为我国肉类消费的主流，在冷鲜肉推广的过程中贮藏期是面临的最大问题之一，只有在保证了冷鲜肉食品质量安全的同时，延长贮藏期，冷鲜肉才能快速稳定的进一步发展[5-9]。

拉曼光谱属于振动光谱的一个分支，是红外光谱的有效补充。可用于检测不同状态食品中蛋白质分子结构的变化[10-14]。二维相关技术将拉曼光谱信号扩展到第二维上，提高了光谱分辨率，简化了含多重重叠峰的复杂光谱，并能通过提供各信号峰之间变化的相关关系，鉴别和研究分子内和分子间的相互作用[15-21]。

本实验通过基于二维相关拉曼光谱法研究4 ℃贮藏期间冷鲜牛肉肌红蛋白相对含量的变化，从蛋白分子角度研究冷鲜牛肉贮藏中色泽变化规律，探明肉色变化特征，为下一步探明高铁肌红蛋白合成和分解的反应原理和富集的原因提供理论依据，合理控制冷鲜牛肉高铁肌红蛋白含量，开发缓解肉色褐变的相应技术，延长冷鲜牛肉货架期，具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

背最长肌 宁夏回族自治区银川市新百超市宁阳店；乳酸、蔗糖、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸（均为分析纯） 银川昕泰生物试剂公司。

1.2 仪器与设备

Inspector 300拉曼光谱仪 美国赛普斯公司；HH.SY21-Ni6-C高速组织捣碎机 江苏金坛市亿通电子有限公司；UV-1200紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

本研究选取宁夏本地2 岁龄左右的秦川牛作为研究对象。将宰后胴体修整后，立即取下背最长肌在0～4 ℃，真空包装保藏。为避免微生物作用因素干扰，获得肉自身生理生化变化对引起肉色变化的数据，样品每天在洁净工作台拆包装后以蒸馏水清洗，用4%乳酸液喷淋杀菌，重新包装后在0～4 ℃条件下保藏。选取屠宰牛肉贮藏期中的8 个时间点检测，以胴体修整作为0 d，分别选取0、3、6、9、12、15、18、21 d八个时间点检测。

1.3.2 肌红蛋白含量测定

参照Krzywicke[22]的方法，取待测5 g肉样，加入25 mL浓度为0.04 mol/L、pH 6.8的磷酸缓冲液，用超细匀浆器在室温条件下以10 000 r/min均质25 s。置均质液与4 ℃冰箱中避光保存1 h，然后与4 500×g，4 ℃离心20 min。将上清液通过滤纸过滤，滤液用分光光度计分别在波长525、545、565 nm和572 nm处测其吸光度，并按下式计算：

式中：P1、P2、P3分别为脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白与高铁肌红蛋白的相对含量/%；R1、R2、R3分别为吸光度比值A572nm/A525nm、A565nm/A525nm、A545nm/A525nm。

1.3.3 拉曼光谱测定

取贮藏0、3、6、9、12、15、18、21 d八个时间点的肉样5 g置于可升降平台上，使待测肉样中心位置放于拉曼光谱50 倍镜头下，进行测定，激光波长为785 nm，功率为10 mW，扫描范围为400～1 700 cm-1，聚焦深度为200 µm。

1.3.4 光谱预处理

拉曼光谱实验中，仪器系统噪声会干扰有用的信息，从而影响模型的建立与预测效果。通常，使用基线校准和曲线平滑对拉曼光谱数据进行预处理，尽量减少干扰。实验用Savitzky-Golay平滑滤波方法进行拉曼光谱数据曲线平滑处理，采用8 点平滑。

1.4 数据处理

首先用2D shige软件对预处理后的验证集样本的拉曼光谱处理，得到其同步二维拉曼相关光谱图。二维拉曼光谱图中包含自动峰与交叉峰，找出随样品浓度变化而变化的多组特征峰。每组特征峰包括一个随样品浓度升高峰强度值（Iinc）而升高的上升峰和一个随样品浓度升高峰强度值（Idec）而下降的下降峰，计算不同浓度样品的每组特征峰的峰比（peak ratio，PR）值，PR=Iinc/（Iinc＋Idec）×100。通过PR值与样品校正集中的肌红蛋白、氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白相对含量的回归方程，PR=K1×肌红蛋白相对含量＋a（K1为斜率，a为截距）。确定拉曼光谱法肌红蛋白、氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白相对含量推导公式。读取检验集样本拉曼光谱（经预处理后）的Iinc与Idec，确定PR值后代入回归方程，得到相对含量。

2 结果与分析

2.1 4 ℃贮藏冷鲜牛肉肌红蛋白拉曼光谱图

由图1可知，902、996 cm-1处的特征峰带较宽，表明变化相对明显，1 023、1 208、1 347、1 625 cm-1处的特征峰带相对较窄，表明变化相对不明显。冷鲜牛肉样品的一维拉曼光谱在900～1 700 cm-1范围内重叠严重，且小峰显示不明显，不容易分辨。从图1可知，各特征吸收峰比较相似，由此可认为冷鲜牛肉样品的一维拉曼光谱图直观上没有较明显的差异。

图1 冷鲜牛肉拉曼光谱图Fig. 1 Raman spectra of chilled beef

2.2 二维相关拉曼光谱

2.2.1 4 ℃贮藏冷鲜牛肉肌红蛋白二维拉曼光谱图

图2 4 ℃贮藏冷鲜牛肉的二维相关谱图Fig. 2 2D correlation spectra of chilled beef

如图2所示，对角线上的为自动峰，对角线外的为交叉峰；阴影填充的部分为负峰，未填充的部分为正峰。其中二维相关光谱图有8 个自动峰，分别为1 033、1 248、1 385、1 426、1 560、1 582、1 605 cm-1和1 665 cm-1；交叉峰分别为1 033 cm-1与1 248 cm-1，1 385 cm-1与1 426 cm-1，1 560 cm-1与1 582 cm-1，1 560 cm-1与1 605 cm-1。正峰与负峰呈轴对称出现，且1 460～1 650 cm-1间含有较多小峰，出现较多杂带的干扰，说明肌红蛋白在常温放置氧化过程中可能产生一些物质对拉曼光谱产生荧光干扰。

不同贮藏时间肌红蛋白的拉曼光谱存在的微小差异可利用二维相关光谱技术显现，而在一维拉曼光谱中不能明确体现。卢明子等[23]发现不同氧化方式下血红蛋白的拉曼光谱存在的微小差异可利用二维相关光谱技术显现。通过加入不同氧化剂，可见较多杂带的干扰，说明血红蛋白在常温放置34 d过程中血红蛋白解聚，球蛋白变性，生成的一些杂质降低了拉曼光谱的信噪比[23-24]。1 248 cm-1特征峰为蛋白质变性和肌红蛋白聚集的主要标志峰，二维相关拉曼光谱中1 248 cm-1自动峰的出现，说明虽然肌红蛋白在4 ℃避光贮藏条件下放置可发生氧化生成高铁肌红蛋白，但是长期放置会导致肌红蛋白解聚，球蛋白已发生不可逆变性。1 460～1 650 cm-1间出现了较多自动峰，在一维拉曼光谱中可见较多杂带的干扰，说明肌红蛋白在4 ℃放置21 d过程中蛋白发生了变性，生成的一些杂质降低了拉曼光谱的信噪比。

2.2.2 一元线性回归定量分析

表1 冷鲜牛肉肌红蛋白拉曼光谱的特征峰峰强度值Table 1 Intensity of characteristic Raman spectral peaks of myoglobin in beef

表2 冷鲜牛肉中肌红蛋白拉曼光谱特征峰的PR值Table 2 PR values of characteristic Raman spectra peaks of myoglobin in beef

将表1中肌红蛋白相对含量为横坐标，与表2中相对应的PR值为纵坐标做一元线性回归，见表3。

表3 PR值与脱氧肌红蛋白相对含量的一元线性回归方程Table 3 Linear regression equation between PR value and DeoxyMb content

由表3可以看出，1 0 3 3～1 2 4 8 c m-1与1 5 6 0～1 5 8 2 c m-1的相关系数r大于0.9 5，1 385～1 426 cm-1与1 560～1 650 cm-1的相关系数r小于0.95。因此，通过PR值评估肌红蛋白相对含量，主要考察1 033～1 248 cm-1与1 560～1 582 cm-1的PR值。

表4 PR值与氧合肌红蛋白相对含量的一元线性回归方程Table 4 Linear regression equation between PR value and OxyMb content

由表4可以看出，1 3 8 5～1 4 2 6 c m-1与1 5 6 0～1 6 5 0 c m-1的相关系数r大于0.9 5，1 033～1 248 cm-1与1 560～1 582 cm-1的相关系数r小于0.95。因此，通过PR值评估氧合肌红蛋白相对含量，主要考察1 385～1 426 cm-1与1 560～1 650 cm-1的PR值。

表5 PR值与高铁肌红蛋白相对含量的一元线性回归方程Table 5 Linear regression equation between PR value and MetMb content

由表5可以看出，1 033～1 248、1 385～1 426 cm-1与1 5 6 0～1 5 8 2 c m-1的相关系数r大于0.9 5，1 560～1 650 cm-1的相关系数r小于0.95。因此，通过PR值评估高铁肌红蛋白相对含量，主要考察1 033～1 248、1 385～1 426 cm-1与1 560～1 582 cm-1的PR值。

将表3～5中相关系数r大于0.95的方程分别进行转置，分别得到脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白的推算公式（蛋白相对含量/%=（PR×a＋b）×100），如下：

脱氧肌红蛋白相对含量计算公式：

1 033～1 248 cm-1：脱氧肌红蛋白相对含量/%=（-0.282 1x＋17.682）×100

1 560～1 582 cm-1：脱氧肌红蛋白相对含量/%=（-0.305 5x＋19.570）×100

氧合肌红蛋白相对含量计算公式：

1 385～1 426 cm-1：氧合肌红蛋白相对含量/%=（-2.933 9x＋154.17）×100

1 560～1 650 cm-1：氧合肌红蛋白相对含量/%=（-2.520 0x＋151.66）×100

高铁肌红蛋白相对含量计算公式：

1 033～1 248 cm-1：高铁肌红蛋白相对含量/%=（1.574 3x-14.369）×100

1 385～1 426 cm-1：高铁肌红蛋白相对含量/%=（1.904 3x-29.292）×100

1 560～1 582 cm-1：高铁肌红蛋白相对含量/%=（1.680 4x-23.718）×100

式中：x为PR值。

表6 待测冷鲜牛肉中肌红蛋白拉曼光谱特征峰的PR值Table 6 PR values of characteristic Raman spectral peaks of myoglobin in beef samples to be analyzed

表7 不同特征峰预测肌红蛋白相对含量Table 7 Predicted relative contents of myoglobin based on different characteristic peaks

由表6、7可得，波数为1 560～1 582 cm-1时，脱氧肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为6.90%，波数为1 033～1 248 cm-1时，脱氧肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为10.3%。因此，波数为1 560～1 582 cm-1时，脱氧肌红蛋白相对含量的预测效果相对较好。波数为1 385～1 426 cm-1时，氧合肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为7.03%，波数为1 560～1 650 cm-1时，氧合肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为9.31%。因此，波数为1 385～1 426 cm-1时，氧合肌红蛋白相对含量的预测效果相对较好。波数为1 385～1 426 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为8.4%，波数为1 033～1 248 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为4.76%，波数为1 560～1 582 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量预测值与实际值的相对平均误差值为12.7%。因此，波数为1 033～1 248 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量的预测效果最好。3 种肌红蛋白相对含量的预测效果为高铁肌红蛋白＞脱氧肌红蛋白＞氧合肌红蛋白。

在清真屠宰充分放血的情况下，肌红蛋白约占80%～90%，为肉色的主要呈色物质。肌红蛋白是球状血红素蛋白质，主要贮存在肉类动物的肌肉中[25-27]。脱氧肌红蛋白与氧气的结合是可逆的，肌细胞内的氧主要通过脱氧肌红蛋白转运和储存，牛肉色泽主要由脱氧肌红蛋白浓度、氧化状态、稳定性以及与其他物质结合情况决定，宰后脱氧肌红蛋白在肉中的3 种氧化还原形态之间会随着贮藏时间、温度、pH值等因素发生变化，从而决定肉的色泽[28-30]。

3 结 论

脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白与高铁肌红蛋白含量的最佳推导公式分别为：脱氧肌红蛋白相对含量/%=（-0.305 5x＋19.570）×100；氧合肌红蛋白相对含量/%=（-2.933 9x＋154.17）×100；高铁肌红蛋白相对含量/%=（1.574 3x-14.369）×100；3 种肌红蛋白含量的预测效果为：高铁肌红蛋白＞脱氧肌红蛋白＞氧合肌红蛋白，其中波数为1 033～1 248 cm-1时，高铁肌红蛋白相对含量的误差值最小为4.76%。

利用二维相关光谱技术可显现在4 ℃不同贮藏时间条件下冷鲜牛肉中肌红蛋白拉曼光谱的微小差异，反映冷鲜牛肉贮藏过程中肌红蛋白发生自然氧化还原反应的情况，从分子结构的角度为冷鲜牛肉贮藏过程中色泽变化与拉曼光谱测定肌红蛋白相对含量方法学的建立提供科学数据和理论依据。

[1] 刘笑笑, 华晶忠, 李树锦, 等. 成熟期间不同部位部位延边黄牛新鲜度变化的比较研究[J]. 食品工业科技, 2011, 32(8): 361-367.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.08.018.

[2] 余倩, 温冬玲. 冷鲜肉中腐败菌抑菌技术研究进展[J]. 江苏农业科学, 2015(8): 269-299. DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2015.08.098.

[3] 李媛媛, 王凯. 南京市消费者冷鲜肉购买行为研究[J]. 广东农业科学, 2015, 42(17): 187-192. DOI:10.3969/j.issn.1004-874X.2015.17.032.

[4] 江琦, 王烨, 刘英, 等. 冷鲜肉的研究进展[J]. 农产品加工: 综合刊,2015(1): 69-71. DOI:10.3969/jissn.1671-9646(X).2015.01.023.

[5] 崔丽萍. 冷鲜肉的现状及对冷鲜肉的监管[J]. 中国动物检疫, 2012,29(4): 27-28. DOI:10.3969/j.issn.1005-944X.2012.04.014.

[6] 潘耀国. 中国肉类消费全景图和大趋势[J]. 西北农林科技大学学报(社会科学版), 2011, 11(1): 1-6. DOI:10.3969/j.issn.1009-9107.2011.01.001.

[7] 成黎. 中国肉类产品质量安全现状及改善控制措施[J]. 食品科学,2010, 31(19): 465-468.

[8] 石学忠, 王明旻. 新形势下加强冷鲜肉监管的几点思考[J]. 河南畜牧兽医, 2009, 30(1): 30

[9] 梁庆华, 邱德生. 肉企连锁专卖有效促进冷鲜肉发展[N]. 中国食品报, 2010-3-3(3).

[10] BARBIN D F, ELMASRY G, SUN D W, et al. Predicting quality and sensory attributes of pork using near-infrared hyperspectral imaging[J]. Analytica Chimica Acta, 2012, 719: 30-42. DOI:10.1016/j.aca.2012.01.004.

[11] BEATTIE R J, BELL S J, FARMER L J, et al. Preliminary investigation of the application of Raman spectroscopy to the prediction of the sensory quality of beef silverside[J]. Meat Science,2004, 66(4): 903-913. DOI:10.1016/j.meatsci.2003.08.012.

[12] BEATTIE R J, BELL S J, BORGGAARD C, et al. Classif i cation of adipose tissue species using Raman spectroscopy[J]. Lipids, 2007,42(7): 679-685. DOI:10.1007/s11745-007-3059-z.

[13] CAREW E B, STANLEY H E, SEIDEL J C, et al. Studies of myosin and its proteolytic fragments by laser Raman spectroscopy[J].Biophysical Journal, 1983, 44(2): 219-224.

[14] HERRERO A M. Raman spectroscopy for monitoring protein structure in muscle food systems[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2008, 48(6): 512-523. DOI:10.1016/j.meatsci.2003.08.012.

[15] NODA I. Advances in two-dimensional correlation spectroscopy[J].Vibrational Spectroscopy, 2004, 36(2): 143-165. DOI:10.1016/j.vibspec.2003.12.016.

[16] 于倩, 武培怡. 二维相关荧光光谱技术[J]. 化学进展, 2006, 18(12):1691-1702.

[17] LIU H, SUN S, LV G, et al. Study on Angelica and its different extracts by Fourier transform infrared spectroscopy and two-dimensional correlation IR spectroscopy[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2006, 64(2): 321-326. DOI:10.1016/j.saa.2005.07.026.

[18] CZARNIK-MATUSEWICZ B, MURAYAMA K, TSENKOVA R,et al. Analysis of near-infrared spectra of complicated biological fluids by two-dimensional correlation spectroscopy: protein and fat concentration-dependent spectral changes of milk[J]. Applied Spectroscopy, 1999, 53(12): 1582-1594.

[19] SASIC S, OZAKI Y. Wavelength-wavelength and sample-sample twodimensional correlation analyses of short-wave near-infrared spectra of raw milk[J]. Applied Spectroscopy, 2001, 55(2): 163-172.

[20] LU C, XIANG B, HAO G, et al. Rapid detection of melamine in milk powder by near infrared spectroscopy[J]. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 2009, 17(2): 59-67.

[21] MAUER L J, CHERNYSHOVA A A, HIATT A, et al. Melamine detection in infant formula powder using near- and mid-infrared spectroscopy[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009,57(10): 3974-3980. DOI:10.1021/jf9024163.

[22] KRZYWICKI K. The determination of haem pigments in meat[J]. Meat Science, 1982, 7(1): 29-36. DOI:10.1016/0309-1740(82)90095-X.

[23] 卢明子. 拉曼光谱应用于高铁血红蛋白检测的探索研究[D]. 长沙:中南大学, 2013. DOI:10.7666/d.Y2425821.

[24] 马君燕. 光诱导的肌红蛋白去氧及人血清白蛋白的光谱学研究[D].大连: 大连大学, 2007.

[25] 陈景宜, 牛力, 黄明, 等. 牛心氧合肌红蛋白的分离纯化及氧化稳定性研究[J]. 食品科学, 2013, 34(13): 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201313001.

[26] MANCINI R A, HUNT M C. Current research in meat color[J]. Meat Science, 2005, 71: 100-121. DOI:10.1016/j.meatsci.2005.03.003.

[27] 陈景宜. 冷却牛肉褪色的生化因素分析及肉色稳定性研究[D]. 南京:南京农业大学. DOI:10.7666/d.Y2361612.

[28] 程妮, 陈卫军. 影响猪肉色因素研究进展[J]. 食品科学, 2006, 27(12):912-916. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.12.235.

[29] MITH G C, BELK K E, SOFOS J N, et al. Economic implications of improved color stability in beef[M]. New York: Wiley Interscience Press USA, 2000: 397-426.

[30] 周光宏. 肉品学[M]. 北京: 中国农业出版社, 1991.

Determination of Myoglobin in Chilled Beef Based on Raman Spectroscopy

ZHANG Tonggang, LUO Ruiming, LI Yalei*, ZHOU Yaling
(School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

In this study, we examined the changes in the relative amounts of three chemical forms of myoglobin,deoxymyoglobin (DeoxyMb), oxymyoglobin (OxyMb) and metmyoglobin (MetMb), in fresh beef meat stored at 4 ℃. For this purpose, one-dimensional Raman spectral data were acquired and analyzed by two-dimensional correlation analysis using 2D-shige software. The optimal formulas for the relative amounts of three chemical forms of Mb were DeoxyMb/% =(−0.305 5x + 19.570) × 100; OxyMb/% = (−2.933 9x + 154.17) × 100; and MetMb/% = (1.574 3x − 14.369) × 100,respectively. The prediction eff i ciency of these formulas was in the decreasing order: MetMb ＞ DeoxyMb ＞ OxyMb. When the Raman frequency was 1 033–1 248 cm-1, the root mean square error of prediction of MetMb was minimum, only 4.76%.Therefore, it is feasible to determine the relative amount of myoglobin using Raman spectroscopy.

Raman spectroscopy; two-dimensional correlation spectroscopy; chilled beef; myoglobin

10.7506/spkx1002-6630-201802033

TS251

A

1002-6630（2018）02-0210-05

张同刚, 罗瑞明, 李亚蕾, 等. 基于拉曼光谱法测定冷鲜牛肉中肌红蛋白相对含量[J]. 食品科学, 2018, 39(2): 210-214.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802033. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Tonggang, LUO Ruiming, LI Yalei, et al. Determination of myoglobin in chilled beef based on Raman spectroscopy[J]. Food Science,2018, 39(2): 210-214. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802033. http://www.spkx.net.cn

2017-05-06

国家自然科学基金地区科学基金项目（31660442）

张同刚（1987—），男，博士研究生，研究方向为畜产品加工。E-mail：372998013@qq.com

*通信作者简介：李亚蕾（1967—），女，教授，硕士，研究方向为畜产品加工与安全。E-mail：yaleili.cn