甲状腺乳头状癌中FHL1基因的表达及临床意义

权明明+++++++陈珍珍+++++++戴岳楚++++++梁勇

[摘要] 目的 研究FHL1蛋白和FHL1基因在甲状腺癌中的表达及临床意义。 方法 分别应用实时定量PCR、蛋白质杂交检测人甲状腺乳头状癌组织标本及结节性甲状腺肿标本中FHL1基因和蛋白的表达情况。 结果 实时定量PCR提示FHL1基因在结节性甲状腺肿中高表达，在甲状腺乳头状癌中低表达，相对表达量为（0.4538±0.0074），差异有统计学意义（P<0.05）；蛋白质杂交提示FHL1蛋白在甲状腺乳头状癌中低表达（0.4033±0.0296），在结节性甲状腺肿中高表达（0.8021±0.0269），差异有统计学意义（P<0.05）。在PTC组中，女性FHL1的阳性表达率为41.4%，男性FHL1的阳性表达率为36.4%，有颈部淋巴结转移的FHL1阳性表达率为42.9%。 结论 FHL1蛋白和FHL1基因在甲状腺乳头状癌中均低表达，提示在甲状腺乳头状癌中FHL1可能起抑制癌细胞的作用。

[关键词] 甲状腺乳头状癌；FHL1基因；FHL1蛋白；抑癌基因

[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）32-0005-03

[Abstract] Objective To study the expression and clinical signifiance of FHL1 protein and FHL1 gene in thyroid carcinoma. Methods Real-time quantitative PCR and protein hybridization were used to detect the expression of FHL1 gene and protein in papillary thyroid carcinoma specimens and nodular goiter specimens. Results Real-time quantitative PCR indicated that FHL1 gene was highly expressed in nodular goiter， and lowly expressed in papillary thyroid carcinoma. The relative expression amount was（0.4538±0.0074）， which was significant from the statistical analysis（P<0.05）； protein hybridization suggested that FHL1 protein was lowly expressed in papillary thyroid carcinoma（0.4033±0.0296）， and was highly expressed in nodular goiter（0.8021±0.0269）， which was significant from the statistical analysis（P<0.05）. In PTC group， the positive expression rate of FHL1 was 41.4% in females， and the positive expression rate of FHL1 was 36.4% in males. The positive expression rate of FHL1 in cervical lymph node metastasis was 42.9%. Conclusion FHL1 protein and FHL1 gene are lowly expressed in papillary thyroid carcinoma， suggesting that FHL1 may play a role in inhibiting cancer cells in papillary thyroid carcinoma.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma； FHL1 gene； FHL1 protein； Cancer suppressor gene

近年來，全球大宗临床数据分析显示甲状腺癌尤其是甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）发病率逐年增高，其发病率占甲状腺癌的90%以上，尤以女性发病率高最为常见，对其发病机理及机制研究也是目前研究的热点之一。本研究旨在探讨FHL1基因和甲状腺乳头状癌发病的内在机制，FHL1（four and half LIM domain protein 1）基因是近年人类发现的一种抑癌基因，在Src和Cas信号通路下游特异性抑制肿瘤细胞的生长和转移。在多种恶性肿瘤如肝癌、肺癌、肾癌中均表达，并且表达是下降的，研究发现其在多种恶性肿瘤发病机制中扮演抑癌基因角色。本文从基因和蛋白方面研究甲状腺乳头状癌FHL1的表达情况，为甲状腺乳头状癌的具体发病机制提供微观生物学证据。

1资料与方法

1.1 一般资料

组织样本：选自浙江省台州市中心医院肿瘤外科2016年1～12月期间的手术切除组织标本。实验组（PTC组）甲状腺乳头状癌40例，男11例，女29例，年龄29～59岁，平均44.3岁。对照组为结节性甲状腺肿40例，男10例，女30例，年龄32～62岁，平均45.2岁。标本体积约5 mm×5 mm×5 mm，重约0.5 g，所有标本病理均经过病理学证实，并且取材经过患者及其家属同意，所有标本留取后于30 min内放置于-80℃冰箱保存备用。

主要试剂及仪器：垂直电泳槽及转膜槽、RNA提取试剂盒、Quant cDNA合成试剂盒、兔抗人FHL1抗体、Real Master Mix（SYBR Green）试剂盒、DAB显色试剂盒、Stepone PCR仪。endprint

1.2 方法

1.2.1 实时定量PCR方法 PCR引物序列（FHL1基因）见表1。提取新鲜的甲状腺乳头状癌及结节性甲状腺肿标本各40例，每例样本重约0.2 g，采用Trizol法提取组织中总的RNA，并且测定RNA提取的浓度及纯度，证明提取的RNA完整。cDNA合成（20 μL反应体系）：反应采用20μL反应体系，依据说明书依次加入试剂，在37℃水浴中放置60 min。参照试剂盒说明完成Real-time PCR。

1.2.2 Western-blotting方法 取出新鲜的甲状腺乳头状癌和对照组标本，每组均40例，每例约0.2 g，按照说明书提取组织蛋白，然后测定总蛋白浓度，配置电泳所需的浓缩胶和分离胶，每个小孔的用量是50 μg，基准Marker为5 μL，100 V电泳，继续15 V电压，经过1 h后将胶移至硝基纤维膜上，然后脱脂奶粉脱脂2 h，滴加Ⅰ抗（FHL1抗体浓度1∶1000），置于4℃冰箱过夜，滴加Ⅱ抗（浓度为1∶5000）室温静置1.5 h，滴加发光液。

1.3 观察指标

实时定量PCR观察指标：收集溶解、扩增曲线，然后计算相对表达量；Western-blotting方法觀察指标：暗室内进行曝光显影定影，最后软件分析蛋白浓度灰度。

1.4 统计学方法

使用SPSS16.0软件包对数据进行处理，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 甲状腺乳头状癌中FHL1基因的表达

FHL1基因与GAPDH的PCR扩增曲线及溶解曲线提示无特异引物二聚体产生，单峰。使用该体系可以对FHL1基因在PTC组及对照组中的表达进行定量分析：结果计算方法采用2-ΔΔCt，FHL1 mRNA在对照组及PTC组均有表达，FHL1 mRNA在PTC组中的表达为对照组的（0.4538±0.0074），差异有统计学意义（P<0.05）。见图1、2。

2.2甲状腺乳头状癌中FHL1蛋白的表达结果（蛋白质杂交）

FHL1蛋白在PTC组中相对表达量是（0.4033±0.0296），在对照组中蛋白质相对表达量是（0.8021±0.0269），FHL1蛋白在PTC组低表达，在对照组高表达，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.3 FHL1蛋白表达与PTC临床病理学参数

在PTC组中，年龄≥45岁的患者为30例，其中11例表达FHL1蛋白，阳性率为36.7%，年龄<45岁10例，其中4例表达FHL1蛋白，阳性率为40.0%；在PTC组中，男11例，其中4例表达FHL1蛋白，阳性率为36.4%，女29例，其中12例表达FHL1蛋白，阳性率为41.4%；颈部淋巴结转移21例，其中9例表达FHL1蛋白，阳性率为42.9%，无颈部淋巴结转移19例，其中8例表达FHL1蛋白，阳性率为42.1%；临床分期为Ⅰ、Ⅱ共35例，其中14例表达FHL1，阳性率为40.0%，临床分期为Ⅲ、Ⅳ共5例，其中2例表达FHL1蛋白，阳性率为40.0%。

3讨论

甲状腺乳头状癌是甲状腺癌最常见的病理类型之一，也是内分泌系统最常见的恶性肿瘤。近年来，其发病率逐年增高，对其发病机制的研究也日益成为热点[1-4]。抑癌基因和原癌基因的表达比例失调目前认为是恶性肿瘤发生的机制之一[5]。我国北京市甲状腺癌发病率在1995年为1.6/10万，而在2010年为9.9/10万，增长了518.8%[6]。同样欧美国家的甲状腺乳头状癌的发病率也是逐年增加的[7，8]。

FHL1的大小为32 kD，其基因位于染色体Xq26.3，FHL1参与细胞的信号传导通路和基因转录的调节，在骨骼肌、心血管系统的分化和发育中起重要作用[9]。FHL1由4个半LIM结构域组成，LIM结构域可以和多种蛋白交互作用并参与细胞的增殖、分化、转录[10]。现有研究表明，FHLI蛋白对多种核糖体蛋白基因具有调控作用，FHL1参与细胞增殖分化、信号转导等多种细胞活动，在多种肿瘤发生和发展中起重要作用[11，12]。FHL1还是转录抑制因子，同时显示FHL1在多种组织中功能不同[13-15]。研究已证实FHL1在多种恶性肿瘤中存在表达，FHL1在多种恶性肿瘤中起抑癌基因的作用，是一种肿瘤抑制因子。FHL1在调节雌激素受体信号传导和乳腺癌细胞的生长中起很重要的作用，通过与雌激素受体相互作用抑制乳腺癌细胞生长[16，17]。FHL1在绝大多数腺癌、肺癌组织中的表达明显下调[18]。刘哲等[19]研究发现：FHL1蛋白在胰腺癌中低表达，并且这种低表达与胰腺癌的侵袭、转移等密切相关。吴成利等[20]研究发现：FHL1在未分化胃癌中低表达，在高分化胃癌中高表达，并且随着病理分期的增高其表达呈下降局势，FHL1参与了胃癌的发生发展过程，是影响胃癌患者术后生存时间的独立因子。

本研究结果证实PTC组中FHL1 mRNA的表达为对照组的（0.4538±0.0074），提示FHL1基因在PTC组低表达，在对照组中高表达。蛋白质杂交结果证实FHL1蛋白在甲状腺乳头状癌蛋白质的相对表达是（0.4033±0.0296），明显低于对照组的（0.8021±0.0269），以上的数据经统计学处理，其差异均有统计学意义（P<0.05），从基因及蛋白层面本实验证实FHL1基因及其蛋白在甲状腺乳头状癌均低表达，推测该基因在甲状腺乳头状癌中起抑癌基因作用。多项研究证实FHL1在胰腺癌、肺癌、胃癌中均出现低表达，推测FHL1在这些恶性肿瘤中起抑癌基因作用，与本实验结果相似。

随着分子生物学的发展，对各种恶性肿瘤的研究已经深入细胞、基因、蛋白层面，FHL1基因是一个近年发现的抑癌基因，已证实FHL1与乳腺恶性肿瘤、肝肿瘤、肺恶性肿瘤、直肠癌等发生密切相关。本实验证实FHL1在甲状腺乳头状癌发生发展中起抑癌作用，其内在的具体机制及其如何启动FHL1基因是值得我们进一步研究的课题，深入探讨甲状腺乳头状癌中FHL1基因的表达情况，为后续甲状腺其他病理类型肿瘤与该基因的研究指明方向。endprint

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（收稿日期：2017-09-12）endprint