瑶药白花丹炮制前后白花丹醌含量测定及小鼠急性毒性试验△

赵湘培 陈少锋* 余胜民 钟 鸣

(1.广西壮族自治区民族医药研究院，广西 南宁 530001； 2.广西中医药研究院，广西 南宁 530012)

实验研究

瑶药白花丹炮制前后白花丹醌含量测定及小鼠急性毒性试验△

赵湘培1陈少锋1*余胜民1钟 鸣2

(1.广西壮族自治区民族医药研究院，广西 南宁 530001； 2.广西中医药研究院，广西 南宁 530012)

目的：比较白花丹生品及炮制品的白花丹醌含量及急性毒性大小，为探讨白花丹炮制机理提供依据。方法采用测定半数致死量的方法对白花丹生品及炮制品的急性毒性进行研究；采用高效液相色谱法测定白花丹生品及炮制品中的白花丹醌的含量。结果白花丹生品及炮制品的LD50分别为88.7 g/kg、99.5 g/kg，其白花丹醌的质量分数分别为0.0136%、0.0041%。结论白花丹炮制后急性毒性显著降低，表明用炮制能减少白花丹醌的含量，降低白花丹的毒性。

白花丹；炮制；白花丹醌；急性毒性

白花丹，瑶族民间称之为“猛老虎”(mongv ndormh maauh，蒙冬卯)或“三钱三”，是瑶医常用特色药材，为白花丹科植物白花丹Plumbago zeylanica L.的干燥全草，主要用于治疗风湿骨痛、骨质增生、跌打损伤、肝硬化和肝脾肿大。具有散瘀消肿，祛风除湿，消炎止痛和杀虫解毒作用[1]。文献及临床应用表明白花丹药材有毒，其中毒症状为：皮肤与其液接触引起红肿，脱皮，误食后会出现麻痹，孕妇误食会引起流产；家畜误食会引起泻下[2]。白花丹醌是白花丹的主要成分，具有抗菌、抗癌等活性，该成分在体内外均有毒性[3-4]。白花丹的毒性，始终是制约其药效的一个因素。酒制法“通血脉”、“祛风”、“杀腥”，“酒制升提，引药上行”多用于活血化瘀药、祛风通络和苦寒类药物[5]，为此，本课题组对白花丹的炮制工艺进行了优选，分别测定了生品及炮制品中白花丹醌的含量，同时对2种样品进行了小鼠急性毒性试验，为白花丹的急性毒性评价提供依据。

1 材料

1.1 药材：白花丹药材，采自广西金秀县，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为白花丹科植物白花丹(Plumbago zeylanica L.)，烘干切片。

1.2 主要试剂与器材：白花丹醌对照品(上海同田生物技术有限公司，YDM7869，纯度>98%)；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为化学纯。

1.3 实验动物：昆明种小鼠，SPF级，体重18～22g，雌雄各半。购自广西医科大学实验动物中心，许可证号：SXK桂2003-0003。动物购回后，雌雄分饲，由专人饲养管理，动物室温度控制在18～25℃，相对湿度控制在50%～60%，动物室按常规定期消毒。

2 方法

2.1 药学研究

2.1.1 白花丹炮制品的制备：取白花丹生品药材1000 g，黄酒200 mL，边加药材边均匀喷洒黄酒(用喷雾瓶均匀喷洒)，文火翻炒，炒至药材微黄，关火，放凉，筛除杂质，剩余的药材存储备用[6]。

2.1.2 白花丹生品与炮制品中白花丹醌的薄层色谱分析：供试品溶液的制备：分别取白花丹生品、炮制品药材粉末约1 g(60目筛)，加甲醇15 mL置锥形瓶中，密塞，超声处理30 min，滤过，滤液加15mL石油醚萃取，取石油醚层蒸干，加甲醇1 mL溶解作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：取白花丹醌对照品10 mg，甲醇溶解，配制成0.1mg/mL的溶液作为对照品溶液。

展开系统：分别吸取白花丹生品及炮制品供试品溶液及白花丹醌对照品溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-丙酮(9:2)为展开剂，展开，取出，晾干，日光检视。

2.1.3 白花丹生品与炮制品中白花丹醌的含量测定[6-8]：色谱条件确定：经实验摸索，通过紫外扫描确定白花丹醌的最大吸收波长为260 nm，以白花丹醌保留时间、峰形、分离度为考察指标，确定以下色谱条件：diamonsil-2 C18色谱柱：(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0-25 min，30%→65%A)，柱温25℃，流速0.8 mL/min，进样量10 μL，检测波长260 nm，检测灵敏度1 AUFS。

2.1.3.1 标准溶液制备：精密称取白花丹醌标准品9.25 mg，用甲醇定容至100 mL，即配制成0.0925 mg/mL的溶液，并储存在冰箱中。

2.1.3.2 供试品制备：所有白花丹样品都研磨成粉末，过60目筛，精密称取白花丹生品及炮制品药材粉末2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，称定重量，超声处理60 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.1.3.3 线性关系的考察：取对照品溶液，分别进样1、2、4、6、8、10 μL，按3.3项下色谱条件进行测定，流速：0.8 mL·min-1，以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，计算标准曲线方程。

2.1.3.4 精密度试验：精密吸取白花丹炮制品溶液，按3.3项下色谱条件连续进样6次，每次10 μL，测定峰面积。

2.1.3.5 重复性考察：称取同一批白花丹炮制品品粉末适量，共6份，分别按“供试品制备”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定RSD值。

2.1.3.6 回收率试验：精密称取已知含量的同一产地白花丹样品粉末适量，共6份，每份2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加含白花丹醌0.0925 mg/mL的对照品甲醇溶液3 mL，再精密加甲醇22 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.3”项下色谱条件测定峰面积，计算加样回收率。

2.1.3.7 稳定性试验：取同一供试品溶液，按2.3项下色谱条件，分别于，于0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，按上述色谱条件进样测定RSD值。

2.1.4 样品含量测定结果：精密称取各批样品适量，分别按“2.3”项下方法制备供试样品溶液，按2.3项下色谱条件进样10 μL，测定峰面积，按外标法以峰面积计算样品中白花丹醌的含量。

2.2 小鼠急性毒性试验:采用半数致死量法。将白花丹生品及炮制品分别 粉碎为粗粉，加水浸泡2 h，以武火煮沸后改文火煎煮30 min，冷却30 min后滤渣取汁。将滤渣再煎煮2次取汁。将药汁混合，浓缩制得每毫升含生药2.5 g的白花丹生品及炮制品水煎液，置冰箱4℃备用。

根据预实验结果，设计白花丹生品和炮制品的染毒剂量。每种样品设5个剂量，其中白花丹生品为70.8、78.7、87.6、97.2、114.4 g/kg；白花丹炮制品为70.8、78.7、87.6、97.2、114.4 g/kg。选用18～22 g的昆明种小鼠，每组10只，雌雄各半，于灌胃前禁食12 h。各组按相应剂量一次性灌胃给药40 mL/kg体质量，对照组给予等容积的蒸馏水。严密观察并记录给药后4 h内动物的反应情况，并连续观察2 W内动物的异常反应及死亡情况。同时，将死亡动物及时进行解剖，肉眼观察主要脏器有无明显病理改变，未死亡动物于2 W后处死，进行尸检，观察主要脏器有无病理改变。

根据改良寇氏法公式计算半数致死量(LD50)：LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]；LD50的95%可信限= lg-1(LD50±1.96×Sx50)；Sx50=i ∑pq/n。式中：Xm=最大剂量组剂量的对数值；i=剂间比的对数值；∑p=各组死亡率之和；p=各组死亡率；q=各组存活率；q=1-p；n=各组动物数；Sx50=logLD50的标准误差。

3 结果

3.1 白花丹醌的薄层色谱分析：供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同的斑点。见图1。

图1 白花丹及其炮制品TLC图谱

3.2 白花丹醌含量测定结果：对白花丹醌含量测定方法学的考察结果显示：线性关系标准曲线方程为：Y=139.93X+19.04 (R2=0.9999)进样量线性范围为0.0231～0.2310 μg，定量限(LOQ)=5 ng/mL，检出限(LOD)=1 ng/mL。表明白花丹醌对照品进样量在0.0231～0.2310 μg之间时，进样量与峰面积之间有良好的线性关系。精密度试验结果表面白花丹醌的RSD为0.37%(n均为6)，表明仪器精密度良好。重复性考察按本次色谱条件进样测定，RSD值为1.64%，表明本方法重复性好。白花丹醌的加样回收率为92.80%，RSD=0.33% (n=6)。稳定性试验中白花丹醌的RSD值为0.64%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。白花丹生品、炮制品中白花丹醌含量分别为0.0136%、0.0041%。炮制后，其含量约为生品的三分之一。

表1 加样回收试验结果

图2 白花丹醌含量测定

3.3 小鼠急性毒性实验结果：在灌胃给予白花丹生品及炮制品后，部分动物3～5 min后相继出现异常兴奋，间歇性抽搐，四肢及尾部颜色发青，部分动物严重惊厥死亡。给药10 min左右，陆续有动物死亡，极个别动物2d死亡。大部分小鼠死亡时，面部、尾发黑。其胃及小肠内含有与样品性状相同的物质，其心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺等重要脏器也未见明显异常。14d后，处死存活动物，解剖观察各脏器，均未见明显异常。

表2 白花丹生品对小鼠的急性毒性试验结果

表3 白花丹炮制品对小鼠的急性毒性试验结果

表4 白花丹生品及炮制品的LD50及95%可信限(g/kg)

由上述表格可以看出，白花丹炮制品组小鼠死亡数量、死亡时间较生品组有所减少并延后，炮制品LD50低于生品，提示黄酒炮制能降低白花丹毒性。

4 讨论

瑶族医药是祖国传统医药的重要组成部分，应用历史悠久。在漫长的医疗实践中，瑶医根据药物的形态、性味功能及临床应用特点将传统常用药物归纳为“五虎、五牛、十八钻、七十二风”，在民间流传[9]。瑶医认为“虎”类药物性能峻猛,见效快，多为消肿止痛类药，有一定毒性[10]。白花丹就是经典瑶药老班药五虎之一，其毒性始终是制约其药效的一个重要因素。

毒性药材的炮制要兼顾“减毒”和“存效”两个方面，不可偏废，否则可能造成效失毒存，或毒去效失[11]。本文考察了白花丹炮制前后白花丹醌含量的变化，发现，黄酒炮制后其白花丹醌含量有所下降，同时，也考察了白花丹炮制前后的小鼠急性毒性，发现黄酒炮制能降低其急性毒性。但是本课题组成员在前期的研究中发现，白花丹经过炮制后，其长期毒性降低、抗CCl4肝损伤作用增强[12-13]。综合本课题组的研究工作说明，白花丹经过炮制后，确实能达到减毒增效的作用。至于白花丹醌是有效成分还是有毒成分，弄清白花丹毒-效关系，还有待更加深入的研究。

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ComparativestudyoncontentofplumbaginandAcutetoxicityofYaomedicine“Plumbagozeylanica”anditsprocessedproducts

Zhao xiangpei1Yu shengmin1Zhong ming2Chen shaofeng1*

1. Guangxi Institute of Minority Medical, Nanning 530001; 2. Guangxi Institute of Chinese Medicine and Pharmaceutical Science, Nanning 530012

Objective: To compare the content of plumbagin and the acute toxicity of Yao medicine “Plumbago zeylanica” and its processed products. Method: HPLC method was used to determine the content of plumbagin, and the classical method of acute toxicity was used to evaluate the acute toxicity of the Plumbago zeylanica and its processed products. Result: The content of plumbagin on Plumbago zeylanica and its processed products was separately 0.0136% and 0.0041%, and the MLD were respectively 88.7 and 99.5 g/kg. Conclusion: Proceeding has certain influence on the content of plumbagin and acute toxicity of plumbago zeylanica.

plumbago zeylanica; proceeding; plumbagin; acute toxicity

广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项课题(GZBZ14-13), 广西科学研究与技术开发计划课题(No.桂科能14123006-6)

赵湘培，女，助理研究员，民族药药理学研究，Tel：18101302217，E-mail：zhaoxiangpei@126.com。

*通讯作者：陈少锋，男，副主任药师，中药、民族药药理研究工作。

R295.1

A

1006-6810(2017)08-0046-04

2017年5月31日收稿