两种毛色牦牛皮肤黑色素组织学分析

高泽成，吴晓云，梁春年，李明娜，阎 萍*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省牦牛繁育重点实验室，兰州 730050；2.甘肃农业大学动物科学与技术学院，兰州 730050)

两种毛色牦牛皮肤黑色素组织学分析

高泽成1，2，吴晓云1，梁春年1，李明娜1，阎 萍1*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省牦牛繁育重点实验室，兰州 730050；2.甘肃农业大学动物科学与技术学院，兰州 730050)

【目的】观察两种不同毛色的牦牛皮肤中黑色素分布。【方法】采用冰冻切片和石蜡切片技术，用甲苯胺蓝和HE染色进行组织学分析。【结果】两种切片方法均能展现毛囊结构、皮肤组织分层结构。甲苯胺蓝染色：石蜡切片比冰冻切片着色较浅，易观察到黑色素的分布；冰冻切片通过显微镜观察发现牦牛毛囊由毛鞘、毛乳头和毛球外围的结缔组织形成。HE染色：冰冻切片着色较深，皮肤结构层次分明；石蜡切片着色均匀，细胞分布明显。【结论】天祝白牦牛表皮的基底层和毛囊周围发现分布着少量的黑色素。大通牦牛的毛囊和表皮中均发现有大量黑色素的存在。大通牦牛毛囊中与毛发相连毛乳头附近的黑色素含量比毛囊周围其他部位含量高，皮肤表皮基底层相对毛囊黑色素含量少。大通牦牛毛囊周围黑色素比天祝白牦牛密集，且更为明显。大通牦牛的毛囊群比天祝牦牛毛囊群密集，毛囊的直径比天祝牦牛的长，毛发较粗。石蜡切片的HE染色是比较好的方法。

牦牛；甲苯胺蓝染色；HE染色；黑色素

动物的毛发是由毛囊发育生长的皮肤衍生物，毛色是动物重要特征之一，它在确定杂交组合、品种纯度和亲缘关系以及评价产品质量等方面均有使用价值。有研究发现毛色与生长速度、瘦肉率及抗病力等均有直接关系[1]。毛囊解剖学与形态发生学研究已经证明，哺乳动物毛发着色主要来源于毛球毛母细胞间成熟黑色素细胞合成的色素[2]。

黑色素颗粒的多少、颗粒性状及分布决定毛发的颜色。生长期结束的特征是黑色素细胞树突收缩，黑色素生成停止[3]。黑色素细胞主要分布在皮肤和毛囊中，视网膜上皮、虹膜、眼葡萄膜、软脑膜和内耳中也有少量分布[4-5]。毛囊黑色素细胞合成的黑色素主要用于形成毛色，具有广泛的生态适应性[6]。谢光耀等[7]研究发现，黑色素细胞在乌骨羊表皮基底层和毛囊中大量分布，并且黑色被毛的毛囊外根鞘部位的黑色素细胞呈现活化状态，是黑色皮肤和黑色毛发的主要来源。

牦牛是青藏高原与藏民族的生产生活密切相关的动物，被誉为“高原之舟”。牦牛毛、绒制品深受喜爱，因此研究牦牛毛色有着重要的社会意义和经济效益，本文拟对两种不同毛色的牦牛皮肤中黑色素分布进行研究。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 采样

3头纯黑色被毛青海省大通成年牦牛和3头纯白色被毛天祝成年牦牛。皮肤组织样品采集：大通纯黑色被毛和天祝纯白色被毛均取自背部左侧(见图1)；液氮和福尔马林固定液保存。

1.1.2 仪器和试剂

石蜡切片机(Leica RM2235)，石蜡包埋机(Leica EG1150H)、组织全自动脱水机(Leica ASP300S)、德国莱卡冰冻切片机，德国莱卡冰冻包埋剂(JUNG tissue freezing medium)，显微镜(Leica DM5500B)、H.E染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，甲苯胺蓝。载玻片、盖玻片、染缸、干燥箱、中性树脂、梯度酒精(100％、95％、90％、80％、70％)、二甲苯、蒸馏水。

1.1.3 冰冻切片的制作

取出液氮保存的组织，待组织变软修块，剪去组织样表皮毛发，大小4mm×4mm×3mm。组织块放入冰冻切片包埋盒中，加入冰冻包埋剂，置-20℃冰箱冷冻，进行切片。分别用甲苯胺蓝和HE染色，镜检。

1.1.4 石蜡切片的制作

取样，修块，大小为4mm×4mm×3mm；脱水：自来水洗24h，5％苯酚(24h)使组织软化，脱水70％(1)、80％(1)、90％(2)、95％(2)、100％(Ⅰ、Ⅱ各 1h)，二甲苯透明(Ⅰ、Ⅱ各 1h)，浸蜡(24h)，包埋，修块，切片，展片(40℃)。进行甲苯胺蓝和HE染色。

2 结果

2.1 冰冻切片

2.1.1 甲苯胺蓝染色

图1 大通牦牛与天祝白牦牛Figure 1 Datong yak and Tianzhu white yak

甲苯胺蓝是一种碱性染料，属于噻嗪类染料，可作为细胞核染剂[8]。两种被毛颜色皮肤组织均能较好的显示牦牛皮肤的黑色素分布。甲苯胺蓝染色结果显示，牦牛皮肤组织学结构与常见哺乳动物皮肤结构大体相似，表皮角质层较薄，真皮层较厚，显示皮肤结构和黑色素颗粒的分布情况。黑色被毛的毛根、外根鞘、毛髓质有大量的黑色素颗粒存在，毛乳头黑色素数量相对较少。在白色被毛毛囊中的毛根部位有少量黑色素颗粒存在，在毛囊的其他部位未发现，但在皮肤表皮基底层有少量黑色素颗粒存在(见图2)。

2.1.2 HE染色

经过HE染色可以明显地观察到黑色素颗粒的分布。可以更加清晰的观察皮肤组织结构分层，真皮层是表皮层的15～20倍。首先黑色被毛毛干中黑色素颗粒分布最多，在毛乳头、外根鞘、皮肤表皮基底层有黑色素颗粒的分布。毛发中的黑色素颗粒比皮肤中的黑色素颗粒更加密集。其次在白色被毛皮肤组织中观察到在毛发的毛乳头、外根鞘没有发现黑色素颗粒的分布，但在皮肤的表皮基底层发现有少量黑色素颗粒的存在。数量和密度均比黑色被毛少和小(未作统计)(见图3)。

2.2 石蜡切片

2.2.1 甲苯胺蓝染色

显微镜下清晰地看到真皮层的毛囊、毛发的结构、黑色素的分布。在毛发生长过程中，基部的黑色素细胞不能看到有黑色素颗粒的生成，毛乳头细胞位于毛球中央，是由大量的结缔组织构成。在天祝白牦牛的毛囊染色发现毛发的根部容易被染色剂着色，周围的黑色素细胞没有产生黑色素颗粒(见图4)。

2.2.2 HE染色

普通的HE染色，黑色素不能清楚地显示，但能清楚地显示细胞结构。在天祝白牦牛的表皮和毛囊周围的黑色素细胞分布密集。大通牦牛毛囊中与毛发相连毛乳头附近的黑色素含量比毛囊周围其他部位含量高。在同一放大倍数视野下发现，大通牦牛的毛囊群比天祝白牦牛毛囊群密集，毛囊的直径比天祝长，毛发粗大。表皮黑色素细胞不规则，它们一般有形成空泡的趋势，细胞核较大，成熟的黑色素细胞还有不明显的树突，有十数个细胞相互接触，形成黑色素细胞簇，有的具有非典型的细胞核或者整个细胞呈现出多形性，部分细胞还存在于真皮和表皮连接处的上方。大通牦牛毛囊周围黑色素细胞比天祝白牦牛的多而且密集，细胞核大，而且更为明显。毛囊是由毛鞘、毛乳头和毛球外面周围的结缔组织形成的。大通牦牛毛囊周围和表皮中的黑色素细胞均产生大量黑色素颗粒，数量多于天祝白牦牛(见图5)。

图2 冰冻切片甲苯胺蓝染色Figure 2 Frozen section toluidine blue staining

图3 冰冻切片HE染色Figure 3 Frozen section HE staining

图4 石蜡切片甲苯胺蓝染色Figure 4 Paraffin toluidine blue staining

图5 石蜡切片HE染色Figure 5 Paraffin section of HE staining

3 讨论

3.1 甲苯胺蓝染色

皮肤组织中存在大量角化细胞和角化蛋白，采用HE染色，着色效果不好，试验采用甲苯胺蓝染色研究牦牛的皮肤组织及毛囊形态结构[9]。在天祝白牦牛中发现，尽管毛色纯白，但经过染色发现在皮肤表皮中也分布着数量较少的黑色素，牦牛生活在高海拔的地区，阳光的紫外线照射强烈，为了适应环境，皮肤表皮的黑色素可以吸收紫外线，减少伤害。年轻的黑色素细胞可分裂，皮肤的颜色决定于表皮细胞内黑色素的多少，而不决定于黑色素细胞的数目[10]。表皮基底层的黑色素细胞合成的黑色素主要用于形成肤色，具有保护作用，使机体免受紫外线伤害[11]。在大通牦牛中发现，有些皮肤表皮并没有黑色素存在，但在毛囊周围发现黑色素。黑色素细胞产生黑色素，并循黑色素细胞树突沿途分送给角质形成细胞，故后者不产生但却含有黑色素。黑色素形如细小的棕色颗粒，存在于基底细胞之间。当黑色素细胞向浅层移位时，这种颗粒渐渐消失，故浅层细胞中着色浅。黑色素主要是由黑色素细胞产生和存储，黑色素细胞根据特征不同分为三个群体：第一类分布在表皮，它们只有少量黑色素沉积；第二类分布于毛囊外根鞘中，它们的形态较小，没有黑色素分泌，但是能够增生分化；第三类分布于毛球部，形态较大并且有大量黑色素分泌，但是却不能增生分化[12-13]。毛囊黑色素细胞合成的黑色素主要用于形成毛色[14]。二是黑色素通过黑色素细胞树枝状突起，向角质形成细胞转移，然后随表皮细胞上行至角质层，随着老化的胶质细胞脱落排出体外[15]。

3.2 HE染色

HE染色法可以判断黑色素细胞的位置和密度，皮肤分层结构[16]。大通牦牛皮肤黑色素细胞分布在表皮基底部、毛球部和毛囊外根鞘部，这与文献报道结果一致[17-18]。大通牦牛在毛囊周围发现黑色素，同时在表皮基底层发现黑色素，在天祝毛白牦牛中发现，毛发纯白，但经过染色发现在表皮中分布着数量较少的黑色素。毛囊的黑色素细胞与表皮的黑色素细胞的调控机理不同或是传到运输机理不同。甲苯胺蓝染色能显示黑色素的分布，有研究已经证明，哺乳动物毛发着色主要来源于毛球部毛母质细胞间成熟黑色素细胞合成的色素[19]，而与毛囊所在皮肤组织中黑色素细胞的数量以及成熟度无关[2]。大通牦牛在毛囊及皮肤基底层发现黑色素在皮肤发育分化早期阶段。乌皮羊与非乌皮羊黑色素细胞的迁移路线可能存在差异[20]。毛乳头是毛发发生的部位，在毛发生长中，毛囊周围的黑色素细胞产生黑色素经过细胞之间的传到运输，经黑色素运输到与毛发直接相连的毛乳头部位，因此在毛囊中毛发的基部与毛乳头相连接的部位黑色素密集。哺乳动物毛发着色主要来源于毛球部毛母质细胞间成熟黑色素细胞合成的色素，而与毛囊所在皮肤组织中黑色素细胞的数量以及成熟度无关[21]。

冰冻切片试讲生物组织置于低温下迅速冻结达到一定硬度后进行切片的一种实验技术。与常规石蜡切片相比，不经过脱水、透明、浸蜡等步骤，因此组织不会收缩，容易保持原状，具有快速、简便、易操作等优点[22]。大通牦牛是野生牦牛与家养牦牛杂交品种，大通牦牛比天祝白牦牛生活海拔地区较高，环境更加恶劣复杂，粗大的毛囊可以生长出较为粗长的毛发，而且毛囊的密度比天祝白牦牛的密度大。这样密集的毛发有利于大通牦牛适应寒冷严酷的生活环境。

4 结论

甲苯胺蓝染色比HE染色较容易看到黑色素颗粒的分布，但是不能很好地对黑色素细胞进行染色；HE染色能充分的对黑色素细胞染色，能够行处看到黑色素细胞的分布和形状大小，细胞结构。黑色素细胞见于毛囊中。也出现在表皮基底细胞之间和其上下方。石蜡切片着色效果好于冰冻切片，但冰冻切片保持组织的新鲜度能显示黑色素的分布。

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Melanin Histologic Analysis of Yak Skin in Two Different Colors

GAO Ze-cheng1，2，WU Xiao-yun1，LIANG Chun-nian1，LI Ming-na1，YAN Ping1*
(1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS，Lanzhou，Key Laboratory of Yak Breeding Engineering of Gansu Province，Lanzhou 730050，China；2.Gansu Agricultural University College of Animal Science and Technology，Lanzhou 730050，China)

【Objective】To study the melanin distribution in two different coat colors of yak skin.【Methods】The experiment used frozen section and paraffin section technique，Toluidine blue and HE dye were used to histologic analysis.【Results】Two kinds of slice methods could show the hair follicle structure，stratification of the skin tissue structure.Toluidine blue staining：paraffin had shallower color than frozen,and easier for observing the distribution of melanin;frozen section showed that yak hair follicle was made up of wool sheath，hair papilla and the bulb outside the surrounding connective tissue formation through microscope.HE staining：frozen section was deeper colored,and had distinct skin structure；paraffin section colored uniformly，and cell distributed obviously.【Conclusions】A small amount of melanin was found in Tianzhu's skin and hair follicles and a large amount of melanin was found in Datong's skin and hair follicles.The hair dermal papilla near the melanin content in Datong yak hair follicles was higher than other parts around the hair follicles,and skin epidermal basal layer relatively less hair melanin content.Hair follicle melanocytes of Datong yak was denser than Tianzhu yak,and more obvious.Datong yak hair follicle group was denser，the diameter of the hair follicle was longer than Tianzhu and with thicker hair.Paraffin section with HE staining was a better method.

Yak；toluidinebluestaining；HEstaining；melanin

S813.1

A

1000-2650(2017)01-0110-06

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.01.017

2016-10-12

牦牛资源与育种创新工程(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-01)；现代农业(肉牛牦牛)产业技术体系(CARS-38)。

高泽成，硕士研究生，主要从事家畜分子生物学研究，E-mail：gaobee@163.com。*责任作者：阎萍，研究员，博士生导师，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：pingyanlz@163.com。

(本文审稿：陈正礼；责任编辑：秦碧雯；英文审稿：刘益平)