甘肃省黄芩灰霉病的发生及其病原鉴定

王艳，杜弢，曾翠云，陈红刚

(甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730030)

·中药农业·

甘肃省黄芩灰霉病的发生及其病原鉴定

王艳1*，杜弢1，曾翠云1，陈红刚1

(甘肃中医药大学 药学院，甘肃 兰州 730030)

目的据2013—2016年调查，甘肃省黄芩灰霉病发生严重，常年发病率为10～15%，严重度2～3级。本研究旨在明确该病在甘肃省的发生情况及其病原菌的分类地位，为该病的防控提供一定的理论依据。方法通过植物病害田间调查确定病害发生情况，将形态学和分子生物学方法相结合确定病原分类地位。结果黄芩灰霉病症状主要表现为在叶片和茎秆上形成褐色病斑，严重时整株叶片干枯，植株死亡。病原菌分生孢子梗褐色，多隔，长宽450.0～716.6 μm×9.4～18.8 μm；分生孢子长椭圆形至椭圆形，无色，大小8.2～16.5 μm ×5.9～8.2(平均10.6×7.3) μm。基于形态学和rDNA ITS基因片段构建的系统发育树分析，将黄芩灰霉病病原鉴定为灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)。结论黄芩灰霉病在甘肃省各个黄芩产区均有发生，依据病害传播规律，将栽培措施和药剂喷施相结合进行病害的防治。

黄芩；灰霉病；形态学；系统发育分析；病原鉴定

黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi为唇形科多年生草本植物，性寒、味苦，具清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效，常用于治疗湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽等症[1-2]，是我国常用的大宗药材之一。野生黄芩主要分布于我国长江以北大部分地区，河北承德为其道地产区，素有“热河黄芩”之称[3-4]。随着黄芩的应用范围的扩大和市场需求量的逐年增大，自20世纪 90年代开始，我国许多省区开始野生驯化和人工栽培黄芩[5]，目前在我国黑龙江、山西、河北、甘肃、山东、内蒙古等地形成了新的栽培产区，在甘肃省陇南、天水、兰州、金昌、武威等地区均有大面积的种植[6-7]。

但是随着人工栽培黄芩面积的逐年扩大，黄芩病害已成为制约其产量和品质的重要因素之一。国内目前报道黄芩真菌性病害主要有5种，分别为：白粉病ErysiphecichorocearumDC.[8]、根腐病Fusariumspp.、茎枯病PhomaasparageSacc.[9]、灰霉病BotrytiscinereaPers.和灰斑病PhyllostictamenthaeBres.[10-11]。其中灰霉病是其主要病害，在各产区均有发生。河北承德在2008—2009年对河北省黄芩灰霉病进行了系统的调查和研究，并提出了一定防治建议[11]。在我省该病自2011年在陇西县被首次发现，病害发病率为10%，严重度为1～2级[10]，近年来该病已扩展至渭源、陇西、和政、天水等地，病害发病率上升至10～15%，严重度2～3级，呈现逐年扩大的趋势。目前国内对黄芩灰霉病的病原仅进行了形态学的鉴定，本文旨在通过调查确定黄芩灰霉病在甘肃省的发生情况，并通过形态学和分子生物学相结合的手段对该病的病原进行准确鉴定，为该病的有效防治提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 调查时期、地点和方法

2013年7月至2016年10月，对甘肃省定西市渭源县锹峪乡大田、陇西县药材示范园及大田、和政药用植物园等的22个田块，在苗期、成株期、采收期进行了黄芩灰霉病的调查，采取“Z”字型5点取样，每点调查10株，记载发病率，严重度。采集典型病株，压制标本，以备病原分离及鉴定。

1.2 病原菌的分离

选取叶部和茎干上症状典型病斑，切取病健交界处组织，在0.1%升汞中消毒1 min，用无菌水冲洗3次后，转移至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，置于25 ℃下黑暗培养，5天后进行纯化并于4 ℃下保存备用。

1.3 致病性测定

在PDA上培养7d的菌落上加入无菌水，并用灭菌的玻棒刮取分生孢子，配制成浓度为每亳升1×104个的孢子悬浮液，用手动喷雾器喷洒于室内盆栽黄芩植株叶片表面，以喷洒无菌水的植株作为对照。将所有植株分别置于密封的塑料小温室内，在12 h光照/12 h黑暗的条件保湿24 h后，取出置于室内，每天观察记录发病情况，并对接种后发病的叶片进行病菌再分离。

1.4 病原菌形态学特征观察

对采集的病害标本描述症状，光学显微镜下观察病原形态，测定分生孢子梗及分生孢子的大小，观察培养病菌培养特性，参照文献[12-13]进行病菌鉴定。

1.5 病原菌核糖体DNA-ITS序列的PCR扩增与分析

1.5.1 病原菌DNA的提取 将菌株接种到PDA平板上进行培养，并用封口膜将培养皿封住，25 ℃培养箱中黑暗培养7d后，用灭菌的解剖针刮取菌丝体，应用真菌基因组DNA的提取采用UNIQ-10 柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司生产Sangon Biotech(Shanghai)Co.，Ltd.)提取病原菌DNA。

1.5.2 rDNA ITS的PCR扩增 ITS rDNA的PCR扩增采用真菌的通用引物，正向引物ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG C，反向引物ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC[14]，由上海生工生物工程公司合成。PCR反应体系总体积50 μL，反应液为：10×PCR buffer(含MgCl220 mmol·L-1)5 μL，dNTP (10 mmol·L-1)0.5 μL，引物ITS1和ITS4各2.5 μL(10 μmol·L-1)，Taq酶(2 U·μL-1)2 μL(以上试剂由生工生物公司合成和提供)，模板DNA 2 μL，在Biometre PCR扩增仪((Biometra Tg PCR，德国)上进行扩增。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 sec，53 ℃退火45 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像仪进行观察并照相。PCR产物委托生工生物工程(上海)有限公司进行纯化和测序。

1.5.3 序列及系统发育分析 经测序所得菌株完整的ITS序列在 GenBank登录，并进行BLASTn搜索，下载相似序列以及葡萄孢属的19种菌的ITS序列，选用核盘菌Sclerotiniasclerotiorum(登录号：GU229817)作为外群，用Clustal X(1.81)进行多重序列比对(multiple alignment)，通过 MEGA 6.0采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 症状

病原菌主要为害叶片、叶柄、嫩茎、花器。叶片多自叶缘发病，向内扩展呈长椭圆形褐色病斑，稍现轮纹，常在叶背长出灰褐色霉状物，粗壮的分生孢子梗肉眼可见，茎秆受害产生大型长条形病斑，茎秆四周的霉状物如毛刷状(见图1A)，上部组织全部变褐，全株叶片干枯死亡(见图1B)。残花上亦长出褐色丝状物及灰色孢子球。

2.2 病原

挑取组织上病原观察，病原菌菌丝无色至淡褐色，粗1.2～1.8。分生孢子梗褐色，多隔，长宽450.0～716.6 μm ×9.4～18.8 μm，直或稍弯曲，壁上有小瘤突。分生孢子长椭圆形、椭圆形。无色，一端稍细，大小8.2～16.5μm×5.9～8.2(平均10.6×7.3)μm。该病在我省陇西、渭源、和政大田均有发生，发病率10～15%，严重度2～3级。

注：A.茎秆、叶片上症状；B.田间病株图1 黄芩灰霉病症状

2.3 致病性测定

将通过常规组织分离获得的菌株TCM-106在室内接种健康植株，经接种的叶片5 d后即出现明显褪绿小型斑点，迅速扩展成不规则形小型斑块，10 d后叶片上症状明显，对照不发病。对接种发病后的病斑再次进行病菌的分离，可获得与原分离菌株一致的病原菌。根据柯赫氏法则，证明接种菌为黄芩灰霉病的致病菌。据菌株的形态特征和培养特性，初步确定该病原菌为葡萄孢属真菌(Botytissp.)。

2.4 黄芩灰霉病病原rDNA ITS系统发育研究

经ITS1和ITS4引物对病原菌进行PCR扩增和测序，得到长度为517 bp的rDNA-ITS序列，将序列提交至Genbank，获得登录号为KX100100。在GenBank中搜索并下载同源序列，构建系统发育树(图2)。该系统发育树共22个菌株，包括外群S.sclerotiorum(登录号：GU229817)，从系统发育树可见，黄芩灰霉病菌(TCM-106)与4株Genbank登录号分别为：AJ716294，KR094468，KP025968，KJ744343的灰葡萄孢菌B.cinerea聚类在一个分支上。因此，通过形态学和分子生物学相结合，确定黄芩灰霉病的病原为灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.

图2 黄芩灰霉病菌(TCM-106)ITS rDNA序列分析

3 讨论

3.1 病原

灰葡萄孢(无性态：BotrytisPers.，有性态：BotryotiniaWhetzel)是一种重要的植物病原菌，生长期和贮藏期的作物均可被侵染而引起灰霉病，症状表现为花腐、果腐及叶斑，病处形成大量的灰色霉层，即分生孢子梗和分生孢子[15]。该属真菌共包括了22个种和一个杂交种[16]，大多数种寄主范围较窄，只侵染一个或几个相似种的寄主，灰葡萄孢(B.cinerea)侵染范围最广，可侵染200多种植物[15]。在甘肃省药用植物病害调查中发现，有多种药用植物发生灰霉病，其中当归、甘草、党参、知母、紫菀等的灰霉病均由灰葡萄孢B.cinerea.侵染引起[10]。在药用植物种植过程中，一定要明确该病的病原，才能采取有效的防治措施，以免造成不必要的损失。

3.2 黄芩灰霉病的防治建议

针对黄芩灰霉病提出以下防治建议：(1)黄芩灰霉病菌多以菌丝体在病残体上越冬，因此，初冬需彻底清除田间病残组织，减少越冬菌源，可减轻来年病害的发生；(2)目前灰霉病在温棚中多有发生，温棚黄瓜、西葫芦、西红柿、茄子以及多种花卉上的灰霉菌可直接传至黄芩引起侵染，特别是棚膜揭开后，孢子大量飞散，为周围黄芩等植物提供了大量菌源，因此黄芩种植地远离温棚和大棚蔬菜；(3)该病在低温、高湿条件下发生严重，降雨多、露时长、湿度大、植株过密等条件下病害发生严重，因此种植过程中需降低田间湿度，注意通风透光；(4)必要时需采用药剂防治措施，可在发病初期喷施2%多抗霉素水剂200倍液、50%乙烯菌核利可湿性粉剂1000～1500倍液、40%嘧霉胺可湿性粉剂800～1000倍液、25%咪鲜胺乳油2000倍液及50%异菌脲可湿性粉剂1000倍液及65%硫菌·霉威可湿性粉剂1500倍液。

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PathogenIdentificationofGrayMoldonScutellariabaicalensisinGansuProvince

WANGYan1*，DUTao1，ZENGCuiyun1，CHENHonggang1

(GansuUniversityofChineseMedicine，Lanzhou730000，China)

Objective：During disease surveys on medicinal plants in Gansu province in 2013-2016，we found that gray mold onScutellariabaicalensiswas a serious disease with 10～15% disease incidence and 2～3 level of disease severity.The study of the disease incidence and the pathogen identification will provide scientific basis to the control of the disease.MethodsThe disease incidence in Gansu province was determined by field surveys.Morphological and molecular methods were combined to identify the pathogen.ResultsThe disease leads to leaf lesions and plant blight.The conidiophore of the causal pathogen is brown，multi septate，450.0～716.6 μm×9.4～18.8 μm in size；the conidia is aseptate，colorless，ellipsoidal，8.2～16.5 μm ×5.9～8.2(mean=10.6×7.3)μm in size.Based on morphological characteristics and rDNA internal transcribed spacer sequence analysis the fungi is identified asBotrytiscinereaPers.S.baicalensisgray mold appears in all the planting areas in Gansu province.ConclusionThe cultivation methods and chemical control methods should be combined to control this disease.

Scutellariabaicalensis；gray mold；morphology；phylogenetic analysis；pathogen identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.016

国家自然基金项目(31460013)；甘肃省自然基金(17JR5RA164)；甘肃省科技计划基础研究创新群体(1606RJIA323)；中央财政引导地方科技创新平台项目；省自然基金(1508RJZA011)

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王艳，副教授，研究方向：药用植物病理学；Tel：(0931)8765393,E-mail：gswangyan101@163.com

2017-07-04)