毛细管电泳柠檬酸- Zn2+体系对异亮氨酸对映体的手性分离

陈 丽, 郑 颖, 陈裕富, 袁秋月, 谢天尧

(中山大学化学学院, 广东 广州 510275)

氨基酸对映体手性分离识别方法中,文献报道所采用的手性选择剂主要有:1.手性氨基酸配体。这类方法通常以中心离子与L- 氨基酸形成的络合物作为手性选择剂,利用手性配体络合交换原理来实现氨基酸对映体的分离分析[1-3]。2.环糊精(cyclodextrin, CD)及其衍生物。环糊精分子具有中空的圆杯状结构,与手性分子形成稳定常数不同的包合物,从而实现氨基酸对映体的分离分析[4,5]。3.冠醚。冠醚是大环聚醚,分子中间形成空穴,能与大小相当的分子形成主- 客体络合物,从而实现分子识别[6,7]。4.天然大环抗生素。大环抗生素具有天然的环状结构和多个手性中心,因此可以作为手性选择剂用于氨基酸对映体的分离[8,9]。5.手性表面活性剂。利用手性胶束中多个手性中心与氨基酸对映体分子之间的氢键作用和空间位阻作用实现对映体的手性识别[10,11]。6.手性离子液体。手性离子液体结合了离子液体和手性物质的优点和特性,已成功应用于手性物质的分离中[12,13]。上述手性选择剂本身就是手性化合物,氨基酸对映体在其构建的手性介质环境中得以实现手性分离。目前,对于在非手性介质的电泳运行液中实现氨基酸对映体的手性识别,尚未见文献报道。

毛细管电泳(CE)因其高效低耗、可供选择的分离模式多、分离柱易于清洗、分析成本低等优点已成为氨基酸对映体分离分析极具吸引力的方法[14,15]。由于绝大部分的氨基酸(除芳香族氨基酸外)没有紫外- 可见吸收,也不产生荧光,因此采用紫外- 可见和激光诱导荧光检测器的CE分析方法,往往需要先进行样品衍生化处理使其具有光学活性。但是,衍生化过程不仅费时麻烦而且有可能使分析物质的结构发生改变,影响分析结果,不利于氨基酸对映体的手性识别分析。电容耦合非接触式电导检测(capacitively coupled contactless conductivity detection,简称C4D)是近年来发展起来一种新型的电导检测方法[16,17]。C4D具有分析对象适用范围广、抗干扰能力强、灵敏度高和重现性好等优点,是毛细管电泳中一种性能优良的检测器,无需衍生化处理,特别适用于检测缺乏光学活性的分子。目前,有关CE- C4D在氨基酸对映体分离检测方面的应用研究报道还较少,CE- C4D在常见氨基酸的分离分析中极具应用前景。本文采用CE- C4D,在非手性介质的电泳运行液2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L柠檬酸+2.0 mmol/L乙酸锌中实现了D,L- 异亮氨酸对映体的手性识别,并对其手性识别机理进行了初步探讨。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

CES2008毛细管电泳仪(配备非接触式电导检测器,中山大学化学与化学工程学院研制); pHS- 3C型酸度计(上海伟业仪器厂);未涂层石英毛细管(45 cm×50 μm,河北永年锐沛色谱器件有限公司); KQ2200型超声波清洗器(江苏昆山市超声波仪器有限公司); SGW型旋光仪(上海仪电)。

氢氧化钠、柠檬酸和乙酸锌(分析纯,广州化学试剂厂); D,L- 异亮氨酸、D- 异亮氨酸,L- 异亮氨酸(层析纯,上海伯奥生物科技有限公司)。所用水为超纯水,由Millipore超纯水机制备。

分别配制0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L柠檬酸、20 mmol/L乙酸锌的水溶液,实验时,各取适量以制得不同浓度的电泳运行液。异亮氨酸用水配制成1 g/L的标准溶液,进样时用电泳运行液稀释至所需浓度。

1.2 实验方法

将毛细管柱的两端在超声波清洗器中超声清洗1 min,依次用0.1 mol/L HNO3溶液、超纯水、0.1 mol/L NaOH溶液、超纯水和电泳运行液分别冲洗毛细管柱5 min。实验中,每2次进样间仅需用电泳运行液冲洗毛细管3 min。分析过程运行10次后,电泳仪两端的储液瓶中需更换新鲜的电泳运行液。电泳运行液为2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L柠檬酸+2.0 mmol/L乙酸锌(pH=7.3)。分离电压+13 kV,电动进样+11 kV×8 s。检测器的输出信号经数据工作站采集到微机中进行实时数据处理、图形显示和数据文件存储。实验在室温(25 ℃)、相对湿度<70%的环境下进行。

2 结果与讨论

2.1 锌离子的手性识别作用

手性配体交换络合法是研究较早的分离氨基酸对映体的方法[1-3]。这种方法通常采用金属离子与L型氨基酸形成的络合物作为手性选择剂,利用氨基酸对映体与手性选择剂之间进行配体交换络合的差异而达到分离。在CE- C4D分离检测异亮氨酸对映体的研究中,我们发现以柠檬酸- Zn2+组成的电泳运行液体系替代传统由金属离子- L- 氨基酸络合物构建的运行液体系,同样可以实现异亮氨酸对映体的手性分离,且柠檬酸- Zn2+体系更为简单高效。试验了其他不同的金属离子,如:Cu2+、CO2+、Ni2+和Mn2+等,结果表明,只有Zn2+对异亮氨酸对映体呈现出手性识别能力,Zn2+浓度是影响异亮氨酸对映体分离度的关键因素。固定D,L- 异亮氨酸质量浓度为6 mg/L,考察了锌离子浓度在0～4.0 mmol/L范围内对分离度的影响,结果见图1。开始随着Zn2+浓度的增加,对映体逐渐得到分离,当Zn2+浓度为2.0 mmol/L时,分离度达最大;继续增大Zn2+浓度,则会引起电泳电流的增大和焦耳热的增加,分离度变差,不利于分离。故本实验选取的Zn2+最佳浓度为2.0 mmol/L。

图 1 锌离子浓度对异亮氨酸对映体分离的影响Fig. 1 Effect of Zn2+concentration on the enantio- separation of D,L- isoleucine Running buffer: 2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L citric acid+c(Zn2+) zinc acetate; separation voltage: 13 kV; electrokinetic injection: 11 kV×8 s.

2.2 CE条件的优化

在CE实验中,需要优化的条件主要有电泳运行液的组成和浓度、分离电压、进样电压和进样时间。

电导检测器输出的分析信号强度取决于待测组分的电导值与电泳运行液背景电导之间的差值。因此,通过选择合适的电泳运行液组成及浓度可以获得最佳的灵敏度和信噪比。异亮氨酸的pI=6.02,且在偏中性的介质中易与Zn2+络合稳定而呈正电荷,因此选择偏中性的电泳运行溶液有利于电泳分离。实验考察了多种常用的电泳运行液体系(乙酸- 乙酸钠、磷酸- 磷酸钠、硼酸- 硼酸钠、三羟甲基氨基甲烷- 盐酸和柠檬酸- 柠檬酸钠等),结果表明:只有在柠檬酸- 柠檬酸钠溶液体系中异亮氨酸对映体才可以获得分离,且具有良好的检测灵敏度。因此本实验最终确定的电泳运行液体系为2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L柠檬酸+2.0 mmol/L乙酸锌(pH=7.3)。

考察了分离电压(8～20 kV)对于分离效果的影响,结果表明:从8 kV开始,随着分离电压的增大,样品峰的迁移时间逐渐缩短,半峰宽变小,对映体的分离度也随之增加;当达到13 kV时,分离度(Rs)最佳;继续增大分离电压,则分离度开始变差。进样电压较低和进样时间较短时,进样量少,灵敏度低;当进样电压较大和进样时间较长时,进样量大,灵敏度明显提高,但会使进样量过多,导致电泳峰形展宽严重,从而降低了对映体的分离度。综合考虑灵敏度、分离度、精密度和分析时间,选择分离电压为13 kV,进样电压为11 kV,进样时间为8 s。

2.3 线性范围、检出限和精密度

在选定的最佳实验条件下,外消旋体的D,L- 异亮氨酸在8 min内其对映体达到了良好的基线分离和灵敏检测(见图1,c(Zn2+)=2.0 mmol/L)。通过标准加入法确定D- 异亮氨酸出峰在前,L- 异亮氨酸出峰在后。单一构型对映体的电泳峰面积与其质量浓度在1.0～20 mg/L范围内呈良好的线性关系,D型和L型异亮氨酸的线性相关系数分别为0.998 7和0.998 5,检出限(S/N=3)为0.4 mg/L。进行了日内(intra- day)和日间(inter- day)精密度测定,以4 mg/L的L- 异亮氨酸为例平行测定6次,结果表明,迁移时间的日内、日间相对标准偏差分别为2.0%和2.2% ,峰面积的日内、日间相对标准偏差分别为4.2%和4.5% 。相同条件下,D- 异亮氨酸具有一致的结果。实验表明本方法具有较高的检测灵敏度和良好的重复性。

2.4 其他氨基酸的干扰试验

在上述优化的实验条件下,考察了其他19种常见氨基酸的干扰情况,结果表明这些氨基酸或是不出峰,或是其出峰时间与目标电泳峰有差异,从而不干扰异亮氨酸对映体的测定。表明柠檬酸- Zn2+体系对异亮氨酸对映体的手性识别具有一定的专一性以及良好的抗干扰能力。

2.5 手性识别机理的初步探讨

在文献[1-3]报道有金属离子参与氨基酸对映体手性分离的CE方法中,金属离子与L- 氨基酸的络合物本身作为手性化合物添加到电泳运行液中(溶液具有旋光性),氨基酸对映体在其构建的手性环境中得以实现手性识别。本文所采用的电泳运行液(2.8 mmol/L NaOH+0.8 mmol/L柠檬酸+2.0 mmol/L乙酸锌)属于非手性介质(溶液本身不具有旋光性),异亮氨酸对映体在上述电泳运行液中得到拆分。因此,本文方法的手性识别机理完全有别于文献报道的方法。为了阐明其手性识别机理,我们设计了多种不同的实验方案。实验结果表明:在保持电泳运行液的pH和离子强度一致的前提下,用无机酸或是一元羧酸(如乙酸)替代柠檬酸,则无法实现对映体的分离,说明柠檬酸除了提供电泳运行液所需的H+外,还参与了手性识别过程。基于上述实验事实,我们认为Zn2+首先与具有三元羧酸结构的柠檬酸可能形成具有“隐形”手性结构的络合物,或可能形成一种类似于金属有机物骨架结构的化合物,然后再与D,L- 异亮氨酸对映体形成具有电泳淌度差别的结合物,从而实现手性分离。鉴于条件所限,更深层次的机理还在进一步研究之中。

3 结论

本文的研究结果表明,采用CE- C4D在柠檬酸- Zn2+体系的电泳运行液中可以实现异亮氨酸对映体的手性分离。因其手性识别机理具有特殊性,尚需采用多种手段,包括理论计算和表征技术对其手性识别机理进行深入研究。本文的研究工作将为氨基酸对映体的手性识别提供一个新方法和新思路。

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