脂肪血管基质组分获取方法及临床应用的研究进展

孙思捷 综述 王克明 马继光 审校

【提要】 脂肪血管基质组分（Stromal vascular fraction，SVF）是抽脂脂肪去除成熟脂肪细胞后剩余的多种细胞及基质成分的组合，主要包含脂肪来源干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）、造血干细胞、内皮祖细胞、巨噬细胞等。其中，ADSCs具有多向分化潜能，并可分泌多种细胞因子，在组织再生及修复中具有重要作用。SVF的获取方法主要包括酶消化法与机械乳化法，但获取标准尚未达成共识。SVF已广泛应用于辅助脂肪移植、面部年轻化、瘢痕及脱发治疗等整形外科领域，也可应用于放射性损伤、骨关节炎、糖尿病等疾病的治疗。目前关于SVF的安全性及临床效果仍存争议，需要基础实验及临床研究探索SVF的最佳获取方法及作用机制，提高SVF临床使用的安全性和疗效，并进一步扩大应用。

自Coleman等[1]将脂肪移植技术标准化后，临床上脂肪移植的开展日趋广泛，但移植后脂肪坏死吸收是临床遇到的关键问题。Zuk 等[2]对发现了脂肪来源干细胞（ADSCs），ADSCs主要分布在脂肪细胞外基质中，是间叶组织来源的成体干细胞，具有多向分化潜能，并可分泌诸多细胞因子 （bFGF、IGF-1、PDGF和VEGF等）。但ADSCs在体外分离、纯化、扩增后再移植，其过程繁琐、费用昂贵，且安全性难以保证。将脂肪组织中的成熟脂肪细胞去除后可得到基质血管组分 （Stromal vascular fraction，SVF），其中除了约2%～10%的ADSCs外，还包含造血干细胞、内皮祖细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、红细胞等细胞组分及细胞外基质。SVF保留了ADSCs在组织再生及修复中的作用。研究认为，SVF中包含多种细胞成分且便于获取，应用效果优于ADSCs[3-6]。目前，获取SVF的方法尚未达成共识，主要为酶消化法与机械乳化法，更加安全、便捷、经济的方法仍在探索中。近年来，SVF已广泛应用于脂肪移植、皮肤年轻化、促进毛发再生及瘢痕修复等方面，也应用于放射性损伤、骨关节炎、糖尿病等疾病的治疗，但具体的作用机制尚未阐明，临床效果也有待进一步证实。本文就SVF的获取方法及其临床应用进行综述。

1 SVF获取方法

1.1 酶消化法

酶消化法是使用蛋白酶消化抽脂获得的脂肪，破坏细胞外基质中的胶原纤维，得到含有不同细胞组分的基质液，再经离心或过滤及静置，得到的最下层沉淀即为SVF[3，7]。

为了简化术中操作，可自动采用酶消化法处理脂肪以获取SVF[8-9]。Aronowitz等[10]对比了四种常用仪器的处理效果，发现其处理时间都在88～115 min左右，其中Celution System仪器处理抽脂脂肪后得到的SVF中干细胞数量最多，残余的蛋白酶最少，且其自动化程度最高。但该设备较为昂贵，国内目前尚无相关的应用报道。

近来有研究报道了另一种酶消化法，并将获取的SVF称为纳米活性脂肪（Vivo nanofat）[11]：使用浓度为 0.2 mg/mL 的蛋白酶处理脂肪，在37℃孵育15 min，330 r/min离心7 min，将得到的脂肪组织用0.6 mm过滤筛过滤，即得到纳米活性脂肪。该方法使用的酶浓度小于分离ADSCs时的浓度，孵育时间短于一般的孵育时间，减少了对细胞的损伤，除了能保留干细胞外，较小的早期分化的脂肪细胞也得到保护，只破坏了终末分化的较大的成熟脂肪细胞。有研究证实，已分化的脂肪细胞可促进脂肪干细胞的分化或增殖，并刺激其分泌细胞因子，进而提高移植脂肪组织的成活率[12]。

1.2 机械乳化法

2013年，Tonnard等[14]提出了机械乳化法：将1 mm孔径抽脂针抽到的微小颗粒经注射器快速对打30次，即机械乳化。该过程破坏了脂肪中的成熟脂肪细胞，再将得到的脂肪乳化液过滤，最终成分被称为纳米脂肪（Nanofat）。与酶消化法相比，该方法可节约手术时间和成本，便于临床应用，目前已在国内外得到推广。纳米脂肪与SVF的成分基本一致，但多了死亡的脂肪细胞碎片，会引起局部炎症反应，轻度炎症反应中巨噬细胞局部浸润，清除细胞碎片的同时还分泌bFGF等细胞生长因子，刺激脂肪干细胞增殖分化，有利于血管生成及移植物存活[15]。但大量死亡细胞碎片是否会引发较重的炎症反应，降低移植脂肪成活率，仍存在争议[16]。去除死亡细胞碎片需要相应的实验技术和设备，耗时且昂贵，目前在临床中难以实现。

Lo Furno等[17]提出在Tonnard法基础上，只进行机械乳化而不过滤，得到的样本称作nanofat 2.0。该方法减少了过滤对细胞的破坏，得到ADSCs浓度更高的SVF，并可减少脂肪污染的风险，保证移植物的安全性。

Raposio等[18]也提出了一种机械乳化的方法，即在超净台上将注射器中的脂肪注射入10 mL试管中，使用振动筛振摇，然后离心，得到的底层基质液即为SVF，用自动移液管将SVF移回注射器进行脂肪移植。Chaput等[19]对比Raposio法与Tonnard法，发现Raposio法得到的脂肪乳化液中成纤维细胞集落形成单位 （Colony forming unit-fibroblast，CFU-F）数量较少，说明ADSCs的增殖分化能力较差，且Raposio法较繁琐，转移抽脂脂肪的过程易造成污染；此外，Raposio与Tonnard的机械乳化法均比酶消化法得到的SVF中的ADSCs数量少10～12倍，细胞因子数量也随之减少。

Pallua等[20]在Tonnard法的基础上提出了一种可提高SVF中ADSCs浓度的方法：将脂肪离心，弃去最上层的油脂相及最下层的肿胀液等，将中间的脂肪组织按照Tonnard法进行机械乳化，得到的纳米脂肪再离心，弃去最上层的油脂相及最下层的基质液等水分，中间的细胞成分被命名为Lipoconcentrate，通过流式细胞术进行细胞分类计数发现Lipoconcentrate比Tonnard法获取的Nanofat中的细胞浓度提高约60%（P＜0.01），其中ADSCs浓度是未经处理的脂肪中的4倍。该方法去除了Nanofat中的油脂及水分，减少了移植物量且提高了干细胞浓度，更适合应用于不需要增加组织体积或局部皮肤张力较大的情况，如皮肤年轻化或促进毛发生长等。

Akgul等[21]认为，SVF中由脂肪细胞破裂释放出的油脂成分，可以促进炎症反应发生及细胞因子分泌，为干细胞分化及胶原纤维生成提供有利环境。Akgul等按照Tonnard法对抽脂脂肪进行机械乳化后离心，将得到的上层油脂成分加入到下层SVF中，分别得到含有5%、10%、15%油脂成分的SVF，并移植到裸鼠背部皮下，45 d后对比移植物组织学形态，发现含有约10%油脂成分的SVF移植效果最好。但该实验是通过裸鼠完成，当油脂成分注射于人体皮下或皮内组织时可能被巨噬细胞等清除而无法发挥作用，因此需要相关临床实验证明其作用及术后效果。

2 SVF的临床应用

2.1 SVF应用于脂肪移植

移植后的脂肪由于血管尚未形成，相对缺血，导致脂肪移植物存活能力下降而被吸收[22]。SVF中的ADSCs可增殖并分化为成熟脂肪细胞，同时ADSCs分泌的VEGF可促进内皮祖细胞分化为内皮细胞，参与新生血管形成，使移植脂肪中血管数量增加，从而提高移植脂肪成活率[23-24]。

传统的自体脂肪移植技术是将抽脂获得的脂肪组织经清洗，或再经离心后直接注射入移植处。Matsumoto等[25]首次提出了细胞辅助脂肪移植 （Cell-assisted lipotransfer，CAL）技术。CAL技术将抽脂脂肪分为两部分，一部分是通过传统的方法获取移植脂肪颗粒，另一部分是将抽脂脂肪经胶原酶消化并离心后得到SVF，将所得SVF加入脂肪颗粒中共同注射入移植处。他们发现，CAL组的移植脂肪成活率比对照组平均高35%。之后，Yoshimura等[26]对40例采用CAL技术进行乳房脂肪填充的患者进行6个月的术后随访，发现患者乳头平面的胸围平均增加约4～8 cm，且外形自然无硬结形成，术后效果满意。Zhou等[27]系统回顾了387例脂肪移植术，发现CAL组的移植脂肪成活率明显高于对照组 （60%vs.45%），尤其在面部脂肪移植中，移植脂肪的存活率提高了19%，而乳房脂肪移植存活率仅提高9%。但CAL技术的临床效果仍存在争议，Grabin等[28]对CAL技术进行了系统回顾，分析认为CAL技术较传统的脂肪移植效果并无明显优势，且在安全性方面值得考虑。目前仍需要更多的基础实验及临床研究，以探索SVF中的不同组分在移植脂肪中发挥作用的机制。

2.2 SVF应用于皮肤年轻化

衰老皮肤中的胶原纤维合成减少、弹性纤维变性以及血管老化，导致皮肤松弛及弹性下降[29]。Mojallal等[30]发现脂肪移植后的小鼠真皮厚度增加约1倍 ，主要是细胞外基质中增加了大量的Ⅰ型胶原纤维及少量Ⅴ、Ⅵ型胶原纤维。Charlesdes等[31]观察注射SVF后耳前皮肤的组织形态学变化，发现真皮乳头层弹性纤维变性减少，新生弹性纤维及新生血管增加。

色素沉着是皮肤衰老的另一表现。黑素细胞将酪氨酸转化为黑色素，酪氨酸酶是该过程的主要限速酶，而ADSCs分泌的TGF-β1可下调该酶的活性，抑制黑色素合成[32]。Chang等[33]将SVF注射到小鼠耳背部皮内后使用紫外线照射，可观察到实验组相比于对照组，其皮肤黑色素合成减少。

2.3 SVF促进毛发再生

毛发的生长呈现周期性，由毛囊周期决定，分为生长期、退行期及休止期，休止期的毛发易脱落，正常成年人至少80%的头皮毛囊处于生长期，衰老、遗传、内分泌失调、精神压力等众多原因会导致毛囊从生长期提前进入退行期及休止期，形成脱发。毛囊干细胞可调控毛囊周期使休止期的毛囊重新进入生长期，未成熟脂肪细胞分泌的PDGF可提高毛囊干细胞活性，刺激毛囊由休止期进入生长期[34]。研究发现，皮内脂肪细胞层在毛囊生长活跃期较厚，而在毛囊生长休止期较薄，若减少转基因小鼠的皮内脂肪组织厚度，会导致其皮肤结构及功能紊乱，出现毛发脱落、皮脂腺分泌异常等，进而证明脂肪细胞在调节皮肤毛囊功能中发挥重要作用。由于SVF较传统的脂肪移植物体积小了许多，且流动性与可塑性强，因此更适合注射于头皮内等张力较高的皮肤组织处[35]。Fukuoka等[36]报道了一项临床研究，对22例脱发患者进行头皮内SVF注射，经过6个月的治疗，患者头发密度明显提高，镜下观察发现单位视野内男性头发平均增加29根，女性平均增加15.6根。目前仍需探究SVF针对不同原因所致脱发的疗效是否一致，以确定SVF治疗的适应证。

2.4 SVF促进瘢痕修复

SVF中的ADSCs可调节血管密度、肉芽组织的形成及胶原纤维的厚度，从而改善瘢痕外观[37]。Jan等[38]发现，注射SVF对减轻瘢痕色素沉着及降低瘢痕硬度最为有效，对瘢痕厚度及凸起程度改善不明显。Uyulmaz等[39]对52名患者进行术后随访发现，注射SVF后的瘢痕明显变柔软，且色素沉着减轻，术后满意度高。但因SVF中富含细胞生长因子，Vallejo等[40]认为其应用于恶性肿瘤切除术后的安全性难以保证，可能导致肿瘤复发。

2.5 其他应用

SVF具有促进血管生成、增加成纤维细胞活性及减轻炎症反应的作用，可应用于各种组织损伤后修复，包括皮肤烧伤、皮肤放射性损伤、糖尿病足等[41-44]。基于SVF中ADSCs的多向分化潜能及其调节炎症反应的作用，已将SVF应用于其他领域，包括骨缺损修复、神经损伤修复[45-47]及炎症性疾病（如克罗恩病、慢性骨关节炎等）[48-49]。

3 总结与展望

综上所述，SVF在临床已得到广泛应用，其中的ADSCs具有多向分化潜能，并可分泌多种细胞因子，在组织再生及修复中具有重要作用，有着良好的应用前景。目前，仍存在以下问题有待研究。①需改进现有方法并继续寻找更为安全、便捷、经济的SVF获取方法，提高其中ADSCs数量及活性[50]。现有方法中，酶消化法获取的ADSCs数量较多，但操作繁琐、花费昂贵，残余的蛋白酶还可能引起机体免疫排斥，带来安全隐患[13，51]；机械乳化法便于操作，但所得ADSCs数量较少且含有大量死亡细胞碎片，细胞碎片及油脂成分可能会引发较重的局部炎症反应，降低移植脂肪成活率[16]，关于死亡细胞碎片的利弊及去除死亡细胞的必要性仍有待研究[52]。②SVF中细胞生长因子刺激细胞增殖分化可能导致肿瘤复发，应用于肿瘤术后辅助脂肪填充及改善切口瘢痕的安全性有待进一步研究[40]。SVF移植注射时的不当操作，还可能引起失明甚至死亡等并发症，需进一步评价SVF的安全性[53]。③已有研究证实，SVF可应用于治疗慢性炎症性疾病，修复骨和神经损伤等[13，41-49]，但作用机制不明。应通过基础实验探究SVF中各组分在炎症反应调节、免疫调节、组织损伤修复中的具体作用机制，以扩大其临床应用范围。