结核病病原学诊断评价方法探讨——与《结核病病原学分子诊断专家共识》作者商榷

杨蕾 王国治 卢锦标

如何更好地利用分子生物学诊断报告服务临床诊断，是困扰临床工作者的难题。为此，中华医学会结核病学分会临床检验专业委员会组织实验室和临床领域的专家对分子生物学诊断技术领域的重要问题进行了讨论，撰写了《结核病病原学分子诊断专家共识》(简称“《共识》”)[1]，并刊于《中华结核和呼吸杂志》2018年第41卷第9期。该《共识》有助于临床工作者与结核诊断试剂研究人员更好地理解最新2017版《WS288—2017 肺结核诊断》的诊断标准，以及提高结核病诊疗人员对分子生物学诊断技术实验室结果的解读能力。但笔者对《共识》中分子诊断与微生物病原学诊断的评价标准与评价结果存在疑义，望与专家探讨。

《共识》[1]认为：“目前已有的结核病实验室诊断技术中，不同检测技术的最低检出限值存在较大差异：GeneXpert方法为131 CFU/ml(注：“CFU”为“菌落形成单位”)，MTB培养为100 CFU/ml，其他分子生物学检测方法为101～103CFU/ml，临床标本涂片为103～104CFU/ml。因此，临床检测标本时，任何一种分子生物学检测方法结果阳性、细菌学检测方法阴性时，应以分子生物学检测结果为准，视为MTB阳性。”该推论所引用的分子诊断的评价方法不够合理，细菌学诊断提供的数据有明显错误[2]，以不合适的论据推出的结论既不严谨也不可能准确。

1. 以CFU为基数计算敏感度不妥。结核病分子诊断无论死菌或活菌均可检测出阳性结果，因此，以CFU为基数计算敏感度遗漏了死菌可能产生的阳性结果，分子诊断实际检测细菌个数多于培养出的CFU数，导致计算的检出率虚高。依据本室检测，以结核分枝杆菌PCR检测试剂盒用国家参考品最低检出量参考品为参照，GeneXpert方法最低检出量为1×103个菌/ml～1×104个菌/ml，高于用CFU/ml描述的数值。

2.以CFU/ml为分子诊断检测评价单位时不合理的另外一个原因。CFU是菌落形成单位。1个菌落可以由1个菌形成，也可以由成百上千个结核分枝杆菌组成的菌团形成。结核分枝杆菌本身就呈分枝状生长，研磨过细可能导致菌体死亡；研磨太粗则形成菌团的可能性大增，而菌团则会导致检测结果虚高。

3.任何检测试剂要达到100%的特异度几乎不可能，分子诊断技术难以完全克服污染的问题。《共识》中提到等温(恒温)扩增技术：“敏感度高但特异度相对较低，对防污染措施要求严格，其自动化程度越高，检测结果可信度越高[1]。”显然，简单认定“分子生物学检测方法结果阳性、细菌学检测方法阴性”时必须认可“分子生物学检测结果”是有缺陷的。

4. 《共识》[1]提供细菌学诊断的敏感度为“MTB培养为100 CFU/ml”，但该处所引的文献依据实际提供的数据是“培养法的敏感度明显高于涂片法，该方法可检出10个细菌/ml[2]”。理论上，所有结核病分子诊断都需一定数量的起始菌方可检出，但培养基中接种上1个活菌就能生长，并且采用膜过滤集菌方式、液体培养等方法还能进一步提高活菌检出率。正常情况下，培养的检出敏感度要求需高于100 CFU/ml。《共识》引用文献的数据[2]提示：培养法的检出敏感度要求要高于《共识》提供的分子诊断法。高检出敏感度要求的方法“细菌培养”未检出，并不能排除低检出敏感度要求的方法“分子诊断”检出的阳性是假阳性的可能。

5.分子诊断技术的特异度易受多种因素的影响，不仅仅与标本处理和实验室交叉污染有关，还与检测机理、检测靶标的特异性、引物设计、扩增次数的设置、阳性判断值灰区值的设置等都有关。现在商业化试剂的防污染措施和阴性对照仅能排除某些非结核分枝杆菌假阳性和交叉污染的影响。一般来说，不同分子生物学方法检测的特异度不同，检测结果的可信度也不同。

综上所述，《共识》提出“任何一种分子生物学检测方法结果阳性、细菌学检测方法阴性时，应以分子生物学检测结果为准，视为MTB阳性”的结论无法成立。

事实上，我们并不排除细菌学检测阴性分子生物学检测阳性的结果多数是正确的诊断。但是，其原因与分子诊断方法无论死菌或活菌都能得出相同的结果提高了核酸阳性检出率有关，与培养方法本身受条件与技术限制影响了培养阳性检出率有关，却与专家组提出的证据无关。建议专家重新收集、整理汇总国内外研究的相关数据并修订上述结论。

同时，应认识到，与其他方法学诊断一样，除了要关注检测方法的时效性、简便性与自动化程度外，病原生物学诊断最关键的依然是方法检测结果的“敏感度”与“特异度”。就结核病病原学分子诊断而言，由于不同分子诊断技术的机理不一样，各厂家研发技术水平不同，不同检测试剂的敏感度与特异度有很大差异。

本室对国内已经批准应用于临床的结核病病原学分子诊断试剂用同一标准物质检测的结果表明，敏感度最高的检测试剂在10个菌/ml时即可检出，敏感度最低的检测试剂需要104个菌/ml时才能检出。据最新发表的数据，专家认可的检测敏感度高的检测试剂及方法，如：Xpert MTB/RIF Ultra，尽管敏感度较前一代产品有所提升[3]，但对培养阳性标本检测的阳性率也只有88%[4]。

建议《共识》撰写专家组对不同试剂盒敏感度的差异是否会影响临床检测结果、目前结核病分子诊断学与细菌学检测结果的关联性提出指导性的意见，否则将无法满足《共识》专家组提出的“提高结核病诊疗人员对分子生物学诊断技术实验室结果的解读能力”的基本要求。我国各级结核病防治机构收治患者的阳性检出率不一，在分子诊断与细菌培养敏感度相当的情况下，“肺结核患者病原学阳性率达到50%以上[5]”的目标恐难以实现。