不同浓度TTC在微生物检测培养基中的应用

□ 李学兴 石 琳 梁 伟 云南省玉溪市食品药品检验所

TTC化学名为2.3.5-氯化三苯基四氮唑，别名氯化三苯四氮唑，在微生物检验中起染色作用，其原理是TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的还原产物，使菌落变红色，便于菌落计数。在微生物检验工作中,菌落总数测定是用于检验样品被污染程度的一项基本指标。现行《中国药典》[1]药品微生物学检测方法以胰酪大豆胨琼脂培养基培养技术需氧菌总数（包括真菌菌落数）；食品检验国家标准中食品微生物学检验的菌落总数测定［2］采用平板计数琼脂培养基培养菌落总数；化妆品国家标准《化妆品安全技术规范》（2015年版）［3］中介绍：在每100 mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基中可加入0.5%氯化三苯四氮唑(TTC)溶液1 mL用于菌落总数的测定的实验方法中。在实验过程中有时候因为被检验样品中含有沉渣（药品药渣、食品中的碎屑、化妆品中的颗粒等），其形态类似细菌或覆盖菌落给菌落计数工作造成一定的困难。为了防止细菌的蔓延生长和便于计数，有时可以加入适量的TTC进行染色从而方便菌落计数，提高菌落计数的准确性。《药品卫生检验方法》（1990年版）［4］指出，一般是1%TTC加到培养基后的最终浓度为0．001%。但实际工作中，常常会碰到一些不正确的做法。目前，有些检验人员在进行微生物学检测时，培养基中加入过量的TTC，这样计数所得的菌落数结果，往往是偏少或不准确。为了解含不同浓度TTC培养基对微生物菌落生长的抑制性，本文对6种菌株加入6个不同浓度的TTC培养基［5］及不加TTC培养基的菌落生长结果进行了考察研究。

1 试验材料

1.1 仪器设备

HRLM-80型立式蒸汽灭菌器（青岛海尔特种电器有限公司）、SPX-150生化培养箱（慧科电子有限公司）、BP1502型电子天平（梅特勒—托利多仪器有限公司）、BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）。

1.2 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号3104855）、0.5%无菌TTC溶液（批号6104032），均由广东环凯微生物科技有限公司生产。

1.2.1 培养基制备

胰酪大豆胨琼脂培养基按照使用说明用蒸馏水配制后采用湿热灭菌处理恒温待用，参考孔秀珍《在化妆品菌落测定中应用TTC的探讨》［6］，临用前用带无菌枪头的移液枪将0.5%无菌TTC加入恒温45 ℃的胰酪大豆胨琼脂培养基中分别制成每100 mL培养基中含TTC为 10.0、5.0、2.5、1.5、1.0、0.5 mg 6个不同浓度。

1.3 菌株及来源

大肠埃希菌[CMCC（B）44102〕第3代；乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50 094]第3代；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]第3代；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]第3代；黑曲霉[CMCC（F）98 003]第3代；金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]第3代。以上菌种均来自中国食品药品检定研究院，所用菌液在实验前取新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液洗脱为菌悬液并用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至最终浓度为每1 mL中含菌落数为50～100 CFU/mL。

2 试验方法

按无菌操作分别用无菌吸管取经稀释含菌落数为50～100 CFU/mL的大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌各1 mL注入无菌平皿，平行制备2个平皿（结果取平均值），然后分别倾注含各不同浓度TTC胰酪大豆胨琼脂培养基15～20 mL，混匀，待凝固后35℃倒置培养72 h计数结果（培养期间逐日观察计数），计数结果见表1。

3 结果分析

实验结果显示，通过不同浓度的TTC胰酪大豆胨琼脂培养基与不加TTC胰酪大豆胨琼脂培养基计数结果对比，在6株供试验的菌株（6株菌株性质分别为：2株革兰氏阳性菌代表、2株革兰氏阴性菌代表、1株真菌代表、1株霉菌代表，其中乙型副伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为食品卫生检验项目的常规致病菌代表。）加入每100 mL培养基10.0、5.0、2.5、1.5、1.0、0.5 mg 6个不同浓度TTC胰酪大豆胨琼脂培养基培养后，大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门氏菌、黑曲霉菌对各个浓度TTC均表现为不敏感；金黄色葡萄球菌在TTC浓度分别为5.0 mg和10.0 mg时表现为生长抑制、生长缓慢，且菌落小如针尖培养至72 h勉强可计数，金黄色葡萄球菌的其他TTC浓度在培养24 h时候菌落即生长旺盛便于计数；枯草芽孢杆菌、白色念珠菌在TTC浓度分别为5.0 mg时表现为有轻微抑制作用,10.0 mg时枯草芽孢杆菌表现为抑制但稍有菌落生长，白色念珠菌表现为完全抑制生长。本次试验中发现，培养基中加高浓度TTC对此次实验菌株的革兰氏阳性菌表现显著抑制，对革兰氏阴性菌表现无抑制，且TTC浓度越高,抑制作用越明显。每100 mL培养基含TTC浓度在0.5 mg及以下时菌落不显红色，TTC已不能起染色作用，因此也失去了其使用价值。本次实验证明加入培养基TTC适宜浓度为1.0～2.5 mg/100 mL，不应达5.0 mg/100 mL（化妆品安全技术规范菌落总数测定中每100 mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基中加入0.5%TTC溶液1 mL达到5 mg/100 mL的浓度有待考究适宜性）及以上浓度，加入过高浓度的TTC培养基检测微生物会使样品中微生物菌落受到抑制，甚至一定浓度的TTC会导致某些菌落种类不生长的情况，从而影响样品微生物计数结果的真实性和判断实验的准确性。

表1 不同浓度TTC培养基各菌落生长情况表

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].中国医药科技出版社 ,2015：81-85.

[2]国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.GB 4789.2-2016食品微生物学检验 菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社,2017.

[3]国家食品药品监督管理总局.化妆品安全技术规范[Z].2015：471-474.

[4]中华人民共和国卫生部.药品卫生检验方法[Z].1990：10-11.

[5][6]孔秀珍.程洁萍.在化妆品菌落总数测定中应用TTC的探讨[J].中国卫生检验杂志,2006(7)：831-832