自噬相关基因Beclin1和LC3在卵巢浆液性癌中的表达及临床意义

晋 龙，眭玉霞，孙 阳，陈小岩，陈志忠，陈灵锋，李艳辉，王丽萍

自噬(autophagy)是细胞对内外环境压力变化的一种反应，是蛋白降解和细胞器循环的途径之一，指双层膜包裹部分的胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并降解其内容物的过程[1]。自噬可以导致细胞死亡，被认为是有别于凋亡的另一种细胞程序性死亡[2]。卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤，由于其位于盆腔深部，早期病变不易发现，故70%的卵巢癌临床确诊时已经属于晚期，易出现盆腔淋巴结转移，因此卵巢癌病死率居妇科恶性肿瘤之首[3]。卵巢浆液性癌(ovarian serous carcinoma, OSC)是卵巢恶性上皮性肿瘤中最常见的病理组织学类型，本文采用免疫组化MaxVision两步法、RT-PCR和Western blot法检测自噬相关基因Beclin1和LC3在OSC中的表达，并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1材料收集福建省立医院病理科2010年1月～2013年6月确诊的63例OSC。所有标本均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋。年龄32～75岁，平均50.3岁。29例>50岁，HE染色后，按WHO(2014)卵巢肿瘤分类标准进行重新分类[4]，将OSC分为低级别17例和高级别46例。临床分期按FIGO(2006)分期标准：Ⅰ期6例、Ⅱ期14例、Ⅲ期33例、Ⅳ期10例，随机选取同期手术切除的20例卵巢浆液性囊腺瘤作对照分析。另选取同期手术切除的10例新鲜OSC组织及其相应癌旁组织，用于RT-PCR和Western blot法进行检测。切除新鲜标本迅速放置于液氮中，再保存于-80 ℃低温冰箱。

1.2试剂Beclin1和LC3兔抗人多克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。兔超敏两步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。逆转录试剂盒、PCR试剂盒均购自美国Promega公司。引物序列由TaKaRa公司合成，引物序列(5′→3′)：Beclin1上游引物：AAACGCATTTGCCATCACA；下游引物：GGACCTTCAGCAGTTTACAGTCAG。LC3上游引物：AAACGCATTTGCCATCACA；下游引物：GGACCTTCAGCAGTTTACAGTCAG。GAPDH上游引物：ACCACAGTCCATGCCATCAC；下游引物：TCCACCACCCTGTTGCTGTA。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物研究所。Super ECL超敏发光液、SDS-PAGE试剂配置购于北京普利莱基因公司。

1.3免疫组化采用免疫组化MaxVision两步法染色，石蜡切片脱蜡、水化后PBS冲洗，过氧化物酶阻断剂封闭内源性过氧化酶活性，加入一抗，室温孵育，加生物素标记的二抗，加链霉素抗生物素的过氧化酶溶液，孵育后滴加DAB显色，苏木精复染，常规脱水，透明，封固。

1.4结果判定Beclin1和LC3以胞质棕黄色颗粒为阳性。随机选取5个高倍视野(×400)，每个视野计数100个肿瘤细胞。按细胞染色强度计分：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分(染色深浅需与背景着色相对比)。按阳性细胞所占百分比计分：无阳性细胞为0分，阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项计分相乘为最终结果：>3为阳性，≤3为阴性[5]。

1.5RT-PCR(1)组织RNA提取，每份冻存标本取大小1 mm3剪碎研磨，用Trizol法分别提取总RNA。(2)cDNA按逆转录试剂盒说明合成。(3)RT-PCR扩增目的基因。PCR反应体系共25 μL：2×PCR Master-Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板5 μL，去离子水5.5 μL，总体积为25 μL。扩增条件：96 ℃ 4 min，1个循环；93 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，合计30个循环。(3)PCR产物的相对定量分析，计算方法：目的基因定量拷贝数=2-ΔΔC(t)，C(t)值是热循环仪中荧光达到阈值的循环数。根据ΔC(t)实验组=C(t)目的基因-C(t)GAPDH，ΔC(t)对照组= C(t)目的基因-C(t)GAPDH，ΔΔC(t)=ΔC(t)实验组-ΔC(t)对照组，对每一标本计算目的基因的拷贝数，取平均值。

1.6Westernblot(1)肿瘤组织总蛋白提取，将OSC和相应癌旁组织约100 mg加入组织蛋白裂解液尽量研碎。(2)按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，取10 μL蛋白样品在SDS-PAGE凝胶上电泳。(3)将电泳分离的样本转移到固相载体PVGE膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗(Beclin1和LC3 工作浓度1 ∶1 000)，β-catin一抗以1 ∶2 000稀释，4 ℃孵育过夜。(4)加入二抗(工作浓度为1 ∶2 000)常温水平摇床孵育1 h。(5)洗膜后ECL反应显影和定影。(6)胶片采用Quantity One图像分析软件进行灰度分析，β-catin作为内参。

2 结果

2.1Beclin1、LC3表达与OSC临床病理特征的关系Beclin1在OSC中阳性率为36.51%，浆液性囊腺瘤中阳性率为65.00%，两者比较差异有统计学意义(χ2=5.02，P=0.025)。Beclin1蛋白表达与肿瘤临床FIGO分期和病理分级有关(P均=0.001)；与患者年龄、发病部位、肿瘤大小及有无盆腔淋巴结转移无关(P>0.05)。LC3蛋白在OSC和卵巢浆液性囊腺瘤的阳性率分别为33.33%和60.00%，两者比较差异有统计学意义(χ2=4.51，P=0.034)。LC3蛋白表达与肿瘤临床FIGO分期和有无盆腔淋巴结转移有关(P=0.013，P=0.041)，与患者年龄、发病部位、肿瘤大小及病理分级无关(P>0.05，表1，图1)。

ABCD

图1A. Beclin1在浆液性囊腺瘤中表达，MaxVision两步法；B. Beclin1在OSC中表达，MaxVision两步法；C.LC3在浆液性囊腺瘤中表达，MaxVision两步法；D. LC3在OSC中表达，MaxVision两步法

2.2Beclin1和LC3蛋白在OSC中表达的相关性在23例Beclin1阳性的OSC中，LC3阳性13例；40例Beclin1阴性的OSC中，LC3阳性8例，通过Spearman相关性分析表明两者呈显著正相关(rs=0.373，P=0.003，表2)。

表2 Beclin1和LC3在OSC中表达的相关性

2.3RT-PCR检测内参基因与Beclin1、LC3基因的溶解曲线呈单一峰值，扩张曲线光滑平稳，荧光吸收图谱曲线似S形，符合定量检测要求。OSC组织中Beclin1和LC3的mRNA相对含量分别为(0.581±0.091、0.650±0.090)显著低于相应癌旁正常组织(t=8.083，t=6.614；P=0.016，P=0.022，图2)。

2.4Westernblot检测Beclin1和LC3蛋白在10例新鲜OSC组织中的相对表达量(0.654±0.061，0.894±0.122)显著低于相应癌旁组织中的表达量(1.423±0.058、1.122±0.082)，两者差异有显著性(t=34.674，t=9.875；P=0.001，P=0.01，图3)。

图2 RT-PCR检测Beclin1(A)和LC3(B)在OSC和癌旁组织中的相对表达量

图3 Western blot检测Beclin1和LC3 蛋白在OSC和癌旁组织中的相对表达量

A.Western blot实验；B.Beclin1/β-catin相对表达；C.LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相对表达；T：浆液性癌；N：相应癌旁组织

2.5Beclin1和LC3表达与患者预后的关系随访截止日期2015年12月31日，随访时间3～63.5个月。5例失访，死亡27例，生存31例。结果显示：Beclin1阳性患者生存率为69.57%，阴性患者生存率42.86%，两者比较差异有统计学意义(P=0.028 3)。LC3阳性患者生存率80.95%，阴性患者生存率37.84 %，两者比较差异有统计学意义(P=0.018 5，图4、5)。

图4 Beclin1阳性组和阴性组OSC患者的生存曲线

图5 LC3阳性组和阴性组OSC患者的生存曲线

3 讨论

细胞的死亡形式有3种：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型程序性细胞死亡，Ⅰ型指凋亡、Ⅱ型指自噬性细胞死亡、Ⅲ型指细胞坏死，三者的形态学表型不同。自噬性程序性细胞死亡表现：在胞质中出现大量的自噬泡，其内包裹着胞质成分和细胞器，并与溶酶体融合后再降解[6]。自噬是既广泛存在于正常的生理过程中，如细胞废物清除、结构重建、生长分化等，同时又可以是一种细胞对不良环境的防御机制，如对抗营养缺乏、电离辐射，并参与多种疾病的病理过程。

自噬是在自噬相关基因的调控下将细胞质中膜包裹的自噬泡降解的过程，在维持细胞代谢平衡及内环境稳定方面至关重要[7]。自噬基因Beclin1可通过影响细胞周期、调节肿瘤细胞的凋亡及调控肿瘤血管生成等参与肿瘤的发生、发展[8-9]。自噬现象贯穿于真核细胞正常生长增殖和病理、生理过程，有研究表明自噬活性的异常与肿瘤发生、发展有直接的关系，目前已经成为探讨肿瘤发生和抑制肿瘤生长及克服肿瘤化疗耐药性研究的热点。

Beclin1基因是第一个被鉴定的自噬基因，是酵母自噬基因Atg6的同源类似物，位于人类染色体17q21上，约150 kb，是哺乳动物参与自噬的特异性基因，通过调节自噬强弱对肿瘤的发生、发展起重要作用[10]。

LC3是哺乳动物细胞中酵母Atg8(Aut7/Apg8)基因的同源物，LC3蛋白主要定位于自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的形成。LC3分为Ⅰ、Ⅱ型，当细胞发生自噬时合成新的LC3，后者经Atg4加工成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ经过泛素样反应酶加工修饰，与膜表面磷脂酰乙醇胺(PE)偶联生成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ的含量或LC3Ⅱ/Ⅰ的比值与自噬体的数量呈正比，因此LC3Ⅱ的含量或LC3Ⅱ/Ⅰ的比值在一定程度上能反应细胞的自噬活性[11]。由于LC3Ⅱ的含量与自噬体的数量呈正比，且在电泳过程中LC3Ⅱ比LC3Ⅰ的迁移速度快，因此可以应用Western blot法检测细胞内LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值变化判断细胞的自噬程度。

本实验结果显示，石蜡标本经免疫组化MaxVision两步法染色，OSC中Beclin1和LC3的阳性率明显低于卵巢浆液性囊腺瘤组织，同时应用RT-PCR 及Western blot检测同期新鲜OSC组织及相应癌旁组织显示，在OSC中Beclin1和LC3的mRNA和蛋白表达均明显低于其癌旁组织。提示自噬相关基因Beclin1和LC3的mRNA和蛋白在OSC中的表达降低，自噬活性水平显著下调，可能参与OSC的发生。另发现Beclin1蛋白表达与OSC患者临床FIGO分期和病理分级有关，LC3蛋白表达与OSC患者临床FIGO分期和盆腔淋巴结转移显著相关，提示Beclin1和LC3表达与OSC的发展和转移密切相关，促进OSC的浸润和转移。同时，研究结果还显示，Beclin1和LC3在OSC组织中蛋白表达呈正相关，可以推测Beclin1、LC3在OSC的发生、发展和浸润转移中发挥协同作用。

文献报道Beclin1和LC3在子宫颈癌[12]、甲状腺乳头状癌[13]、胰腺癌[14]、肝癌[15]等恶性肿瘤中呈低表达，本实验结果与之相符，但也有研究显示Beclin1和LC3在胃癌[16]、食管癌[17]、结直肠癌[18]等恶性肿瘤中呈高表达。自噬在不同器官肿瘤或同一器官不同类别肿瘤，甚至同一肿瘤的不同发展阶段中的表达报道不同。提示自噬在恶性肿瘤的发生、发展中可能起双重作用，对不同肿瘤、不同阶段发挥促进或抑制作用。

本组分析Beclin1和LC3表达与OSC患者生存及预后的关系，结合随访资料发现，死亡患者中Beclin1和LC3的阳性率低，而生存患者中Beclin1和LC3的阳性率高。生存曲线结果显示：Beclin1和LC3阳性患者的预后好于Beclin1和LC3阴性患者，提示Beclin1和LC3可能作为判断OSC临床预后的生物学指标。

综上所述，Beclin1和LC3在OSC中表达降低，导致自噬功能减弱，可能与OSC的发生、发展和预后不良相关。随着本实验组研究不断深入[19]，通过诱导干预肿瘤细胞的自噬活性，如过表达Beclin1和LC3基因，诱导肿瘤细胞的自噬死亡，为OSC的肿瘤临床治疗领域提供新的基因靶点。

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