食管鳞状细胞癌中GFRα3蛋白的表达及临床意义

陈雅琪，蹇顺海，黄一凡，文 彬

食管癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，95%的组织学类型为鳞状细胞癌。GFRα3蛋白是胶质细胞源神经营养因子配体家族成员ARTN的特异性受体之一。GFRα3蛋白与ARTN特异性结合，能激活下游信号通路[1]。研究发现，GFRα3蛋白在胰腺癌及乳腺癌等恶性肿瘤中表达，促进胰腺癌的神经侵袭[2]；与乳腺癌淋巴结转移、临床分期及预后相关[3]。目前尚无GFRα3蛋白与食管鳞状细胞癌病理特征相关的研究，本实验通过检测GFRα3蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达，探讨其与食管鳞状细胞癌发生、发展、侵袭、转移以及预后的关系。

1 材料与方法

1.1材料(1)收集2009年1月1日～2010年9月30日川北医学院附属医院存档确诊的食管鳞状细胞癌石蜡标本114例，患者年龄39～82岁，平均(57.2±4.23)岁，另选取高级别上皮内瘤变及原位癌标本17例，年龄42～75岁，平均(59.6±6.37)岁；癌旁正常食管组织25例作对照，年龄49～78岁，平均(61.4±5.72)岁；所有标本术前均未经放、化疗，术前签署相关知情同意书，符合医学伦理学规定。 (2)收集2014年3月～2014年6月川北医学院附属医院心胸外科手术切除的新鲜食管肿瘤组织及距肿瘤大于5 cm的正常组织12对，年龄42～72岁，平均(59.4±5.12)岁，其中男性9例，女性3例，术后确诊为食管鳞状细胞癌；切除后置于冰上，生理盐水冲洗后分装于冷冻管，放于冷冻盒中于-80 ℃冰箱保存。所选样本来源的患者术前均未经放、化疗，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1免疫组化 GFRα3蛋白兔抗人多克隆抗体购自Atlas公司(HPA020731稀释浓度1 ∶600)，所选蜡块冷冻后每个切片3 μm厚，以胰腺癌标本做阳性对照，组织本身做阴性内对照，免疫组化采用SP两步法检测GFRα3蛋白的表达。GFRα3蛋白阳性信号呈棕黄色颗粒，定位于鳞状上皮细胞膜或细胞质。结果判定以GFRα3蛋白阳性染色范围及着色强度共同确定，按阳性细胞所占百分比计分：无阳性细胞为0分，<25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分。按着色强度计分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两者分数相加为总积分，由两位副高及以上级别病理医师共同打分，最后取平均分，≤2分为阴性(-)，3分为弱阳性(+)，4～5分为中等阳性()，6～7分为强阳性()。

1.2.2Western blot检测 蛋白提取，BCA蛋白浓度测定，凝胶配置试剂盒、上样缓冲液、电泳液、转膜液、PVDF膜、超敏ECL发光液购于碧云天公司。具体操作步骤按试剂盒说明书进行，取食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织各100 mg，加入液氮研磨成粉，按100 mg加入裂解液400 μL，充分混匀，冰上裂解，低温离心，取上清液分装，上清液按4 ∶1加电泳缓冲液于PCR仪上99 ℃变性15 min，与配置好的凝胶上样电泳，浓缩胶80 V至分离胶时，改为120 V电泳至分离胶底部，剪裁与胶相适大小PVDF膜，甲醇中活化15 s，转膜，5%脱脂奶粉封闭3 h；4 ℃冰箱内一抗(GFRα3蛋白浓度1 ∶250，GAPDH浓度1 ∶2 000)过夜，次日常温二抗(1 ∶5 000)60 min，ECL发光，图像采集。

1.3统计学方法所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，组间对比采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier曲线，用对数秩检验图表示。

2 结果

2.1不同食管组织中GFRα3蛋白的表达GFRα3蛋白主要定位于细胞膜和细胞质，呈棕黄色或棕褐色。GFRα3蛋白在25例正常食管黏膜上皮中不表达，在高级别上皮内瘤变及原位癌组织和食管鳞状细胞癌中的阳性率分别为29.4%、76.3%。其在癌组织的阳性率明显高于高级别上皮内瘤变及原位癌组织、正常食管黏膜上皮，差异有统计学意义(P<0.01，表1，图1)。

ABCD

图1A.GFRα3蛋白在食管鳞状细胞癌细胞膜和细胞质中呈()，SP两步法；B.GFRα3蛋白在食管鳞状细胞癌细胞膜和细胞质中呈()，SP两步法；C. GFRα3蛋白在食管鳞状细胞癌细胞膜和细胞质中呈(+)，SP两步法；D. GFRα3蛋白在原位癌组织中呈(+)，SP两步法

表1 不同食管组织中GFRα3蛋白的表达

N为正常组织；H+S为高级别上皮内瘤变及原位癌组织；ESCC为食管鳞状细胞癌组织；△与H+S比较，P<0.05；○与ESCC比较，P<0.01；◇与N比较，P<0.01

2.2GFRα3蛋白表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系114例食管鳞状细胞癌中，男性89例，女性25例；年龄39～82岁，中位年龄57岁。统计GFRα3蛋白与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系，GFRα3蛋白表达与浸润深度、TNM分期有关(P<0.05)；与患者性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移无关，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 GFRα3蛋白表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系

2.3Westernblot检测GFRα3蛋白在食管鳞状细胞癌及癌旁组织中的表达术中搜集并经术后病理确诊的食管鳞状细胞癌组织12例，以距离其大于5 cm的癌旁组织为对照。Western blot检测并以相对分子质量3.6×104的GAPDH作内参，相对表达量以GFRα3蛋白与GAPDH灰度值比值表示，观察GFRα3蛋白在两组中的表达。结果发现GFRα3蛋白在食管鳞状细胞癌组织和正常组织中均有不同程度的表达，且在食管鳞状细胞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.01，图2)。

图2 食管鳞状细胞癌组织及正常组织中GFRα3蛋白的表达

2.4生存分析评价GFRα3蛋白表达与食管鳞状细胞癌患者预后的关系，本实验通过电话对患者进行回访，以手术出院之日开始随访，随访60个月共获得39例资料。其中18例存活，总生存率46.2%。13例GFRα3蛋白阳性生存率为23.1%(3/13)，26例阴性组生存率57.7%(15/26)，GFRα3蛋白阳性组生存率明显低于阴性组，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 食管鳞状细胞癌组织中GFRα3蛋白表达与患者生存率的关系

3 讨论

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，类型以鳞状细胞癌为主，我国是食管癌的高发地区，2012年新发病例和死亡病例达22.3万和19.7万，约占全球发病和死亡人数的一半，5年生存率约20%[4]；在川东北地区食管癌发病率位居第一位[5]。食管癌患者早期临床症状不明显，不易被发现，有症状者入院时检查发现大多已为中晚期，是造成患者死亡的重要因素。因此，寻找新的早期诊断方法至关重要。GFRα3蛋白为糖基化磷脂酰肌醇细胞膜表面受体，是胶质细胞源神经营养因子受体家族成员之一，位于染色体5q31.2，编码400个氨基酸[6]，与其上游神经营养因子配基ARTN及下游的定位于细胞膜上的因子RET形成复合物，向细胞内传导信号[7]，除维持机体神经元存活外，也与恶性肿瘤的发生相关[8]，但GFRα3蛋白在食管鳞状细胞癌中的作用尚不明确，本实验分析GFRα3蛋白在食管癌前病变及食管鳞状细胞癌中的表达，肿瘤发生是逐步演化的过程，从正常组织到高级别上皮内瘤变及原位癌组织，GFRα3蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.01)，肿瘤发展到鳞状细胞癌GFRα3蛋白表达进一步升高(P<0.01)，Western blot实验也证实GFRα3蛋白在鳞状细胞癌组织中表达高于正常组织(P<0.01)，随着疾病发展，GFRα3蛋白表达逐级升高，临床上可通过检测GFRα3蛋白表达水平来预测疾病进展。

此外，研究还发现，GFRα3蛋白表达水平与患者肿瘤浸润深度、临床分期及预后相关，浸润越深，GFRα3蛋白表达越高；临床分期越晚，GFRα3蛋白表达越高，术后生存率越低。提示在食管鳞状细胞癌临床进展中，GFRα3蛋白也起重要作用。其作用机制不明，可能与其上游配基因子ARTN一样，通过促进肿瘤细胞增殖及生存期来促进肿瘤生长，并促进上皮到间充质的转变及血管生成加强癌症干细胞的生物行为，进而表现为肿瘤的生物学行为[9-10]。另查阅文献GFRα3蛋白能在其他恶性肿瘤中表达，Wu等[3]应用免疫组化及原位杂交法分析GFRα3蛋白及mRNA在乳腺良性病变及乳腺癌组织中的表达，发现GFRα3蛋白在乳腺癌组织中的表达明显升高，并与淋巴结转移、临床分期、HER-2表达及预后相关；朱栋良等[2]研究 GFRα3蛋白的表达与胰腺癌生物学关系，结果发现GFRα3蛋白与胰腺癌临床分期、淋巴结转移及神经侵袭相关。

以上研究结果与本实验大致相符，但是在食管鳞状细胞癌中，GFRα3蛋白表达与淋巴结转移无关，这与以上两种恶性肿瘤不符，推测原因：(1)GFRα3蛋白是一个与神经侵袭相关因子配基受体，可能本实验选取样本神经侵袭与淋巴结转移是两个独立的过程，两者之间无明显影响，与缪锦峰等[11]的观点相符；(2)不同组织起源肿瘤之间发病机制本身存在差异，GFRα3蛋白是否与食管鳞状细胞癌神经侵袭有关，对食管癌扩散方式的认识、治疗方法的选择意义重大。

综上所述，本实验证明GFRα3蛋白在食管癌前病变到食管鳞状细胞癌进展过程中表达逐渐升高，且与患者临床分期及预后相关，推测GFRα3蛋白参与食管鳞状细胞癌的发生、发展，有望成为患者临床分期及预后的新生物学指标。

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