外泌体来源microRNA与心肌梗死的关系

石虎伟，韩志君，杨承健

外泌体是由细胞内的多囊泡小体或胞芽与细胞膜融合后释放到胞外的小囊泡[1]。外泌体中含有细胞特异性的蛋白质、mRNA、microRNA（miRNA）和lncRNA等大分子物质[2]，并可将这些物质传递到邻近或远距离的靶细胞，从而发挥作用。在血液、尿液、胆汁、唾液等体液中都可发现外泌体[3-6]。不同细胞来源的外泌体含有相关特征的蛋白质，例如肠上皮细胞分泌的外泌体中含有代谢酶，免疫细胞分泌的外泌体中含有与抗原提呈相关的蛋白质，主要组织相容性复合物Ⅰ类及Ⅱ类分子[7]。

成熟的miRNA大约由22个核苷酸组成，通过与靶mRNA的3′非翻译区（3′UTRs）特异性结合，促进靶mRNA的降解或者抑制其翻译。miRNA对靶基因的调控并非专一，研究显示一个miRNA能够调控多个不同的mRNA，而一个mRNA亦可同时被多个miRNA调节[8]。研究发现，miRNA在组织中呈特异性分布，如miRNA-208（miR-208）仅在心肌中表达，且不受其他损伤的干扰[3]。已经证实与心血管疾病发生密切相关的miRNA有miR-1、miR-126、miR-133a、miR-299、miR-499、miR-208等[9]，还有大量调控蛋白及靶基因的miRNA需要深入的研究探讨。

心肌梗死是冠状动脉粥样斑块破裂或糜烂，伴有不同程度的表面血栓形成、血管痉挛以及远端血管栓塞导致的急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。心肌梗死后，外周血中外泌体来源的miRNA大量增加，参与心血管疾病的发生发展[10]。

1 外泌体来源miRNA与心肌梗死的早期诊断

检测外周血中外泌体的水平显示，在合并有心血管危险因素或罹患心血管疾病的患者中升高。外泌体在形成期间，装备有来自其亲本细胞的表面分子，及选择的胞质内含物（miRNA）。因此外泌体数量和成分有望成为心肌梗死特异性标志物。心肌细胞分泌的外泌体中含有肌节蛋白、线粒体蛋白、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和热休克蛋白-20等[11]。外泌体中的蛋白组成取决于细胞的功能状态，不同程度的应激状态，其分泌的外泌体中蛋白质也不同[12,13]。外泌体的蛋白组成不仅反映其细胞来源，也反映该细胞的状态[14]，可作为某些疾病的诊断标志物。miR-133a原位杂交表明，在急性梗死心肌和梗死周边心肌含量均很低；心肌细胞在钙离子浓度升高后会释放包含miRNA的外泌体。将钙离子载体A23187加入培养基中刺激H9c2心肌细胞，然后测定培养基外泌体中miR-133a浓度，显示钙离子载体A23187诱导miR-133a呈剂量依赖性释放。这些结果提示，心血管疾病患者血液中miR-133a水平升高主要来源于损伤心肌。循环miR-133a可作为心肌细胞损伤的早期诊断标志物[15]。另外，有研究表明，外泌体内与P53基因相关的多种miRNA（miR-92、miR-194以及miR-34a）在急性心肌梗死后心力衰竭的早期阶段明显上升[16]。外泌体来源的miR-1、miR-208a在急性心肌梗死患者的尿液及大鼠模型的血液中升高[17]。因此，这些外泌体来源的miRNA亦有望成为心肌梗死早期诊断标志物。

2 外泌体来源的miRNA在心肌梗死中的保护作用

心脏分泌的外泌体既可以调节心肌修复，也可以远距离传递生物信息，发挥作用的可能是内容物miRNA和蛋白质。Kuwabara等[15]研究发现，心血管疾病患者升高的miR-133a来源于损伤的心肌。循环中的miR-133a可以作为心肌损伤的标志物。在心肌梗死区和梗死周边区，心肌细胞会分泌外泌体，外泌体中含有特异性miR-133a和miR-1，从而血清中miRNA显著增多，促进血管生成，调节心肌修复，此外外泌体来源miR-126、miR-130可以发生类似作用[18,19]。Transwell迁移实验显示上调外泌体来源miR-1可以增强基底膜内的血管和胶原基质形成，并增加人源性心肌祖细胞运动。通过Western blot、荧光定量PCR、荧光素酶报告基因检测，发现miR-1直接抑制Sprouty相关spred1基因，敲除spred1基因将会上调miR-1促进血管生成。利用系统生物学的方法，发现在人源性心肌祖细胞，miR-1调控血管生成有关的基因网络，包括spred1通路。上调miR-1可以提高人源性心肌祖细胞血管分化，促进血管新生[20]。研究人员对大鼠和猪通过缺血/再灌注诱导急性心肌梗死模型，向冠状动脉内输注心源性细胞外泌体（CDCexo），并且以惰性成纤维细胞外泌体（Fbexo）作为阴性对照，2 d后，对梗死面积进行量化，从心脏组织或骨髓中分离巨噬细胞进行下游分析，使用RNA测序来检测巨噬细胞（MΦ）中的外泌体含量和基因表达谱的变化，再灌注后，CDCexo（而不是Fbexo）的输注降低了大鼠和猪心肌梗死面积。此外，CDCexo会减少梗死组织内CD68阳性的巨噬细胞数量，并改变巨噬细胞的极化状态，这类似于心源性细胞（CDCs）诱导巨噬细胞的作用。相对于Fbexo，CDCexo内富集了几种miRNA（包括miR-146a、miR-181b和miR-126）。对CDCexo诱导的巨噬细胞的全转录组数据的反向通路分析发现，miR-181b在CDC引起的巨噬细胞极化过程中的变化显著，而且蛋白激酶Cδ（PKCδ）是该miRNA的下游靶点。另外，为惰性Fbexo选择性地包裹miR-181b后，也能改变巨噬细胞表型，并在心肌梗死大鼠中发挥心脏保护作用。研究数据显示miR-181b从CDCs到巨噬细胞的外源转移降低PKCδ转录水平，这是再灌注后CDCs的心脏保护作用的分子基础[21]。研究表明，来自心肌内注射诱导的多能干细胞释放的外泌体可以向心肌细胞传递保护性miR-21及miR-210，减轻心肌缺血/再灌注损伤[22]。

3 外泌体来源miRNA与细胞移植治疗心肌梗死

细胞疗法是将胚胎干细胞、心肌祖细胞、CD34+细胞群等具有分化能力的细胞通过冠状动脉注射或心肌穿刺等方法注入到心肌中，替代损伤的心肌，甚至分化成为具有收缩功能的心肌细胞，减小梗死面积，促进血管新生，改善心脏功能[23]。有研究介绍了在缺血性心脏病中，基因与细胞治疗联合能显著改善移植细胞的存活，其中外泌体来源miRNA的转移起重要作用。尽管干细胞治疗心肌梗死能够显著改善心功能，但一直面临移植细胞存活率低的问题。低氧诱导因子1（HIF1）能够介导缺血的适应反应，心肌梗死后6周，CPCs+MC-HIF1处理组的射血分数最高，其次是MC-HIF1处理组，CPCs+MC-GFP处理组。心脏内皮细胞产生的外泌体能被心脏祖细胞（CPCs）获取。过表达HIF1的内皮细胞产生的外泌体中miR-126和miR-210的水平较高。这些miRNA在受体CPC中激活，诱导糖酵解转化，提高对低氧的耐受性。抑制此类miRNA削弱外泌体保护作用。提示，HIF1能够调节微环境，从而提高移植细胞的存活。外泌体中的miRNA从宿主细胞到移植细胞的转移提示了一个潜在的靶点来改善移植细胞的存活率[24]。有研究发现急性心肌梗死后miR-150在骨髓单核细胞的表达量下降，从而引起蛋白CXCR4的表达量升高，诱导骨髓干细胞迁移到受损心肌处，改善心肌[25]。来自英国的研究人员使用主动脉瓣手术得到的心包液发现，与外周血浆相比，心包液富含在患者心肌和血管系统中表达的miRNA的外泌体。这些外泌体转移let-7b-5p到内皮细胞（EC），从而减少TGFBR1表达，改善EC的存活、增殖和成血管，总之，心包液富含心脏分泌的miRNA，并通过外泌体传递这些miRNA介导血管反应，协调血管修复[26,27]。Nguyen等用骨髓间充质细胞分泌的有生物活性的细胞因子、外泌体注射到梗死心脏，提高心肌梗死后新生血管的形成、促进心肌细胞存活、降低心脏纤维化[28]。例如胚胎干细胞源外泌体可向受体CPCs传递miR-294，促进心脏祖细胞的存活及增殖[29]。移植的干细胞可以释放含有miR-1、miR-126的外泌体，Spred1蛋白可以抑制血管再生，外泌体来源的miR-1、miR-126可以降低Spred1蛋白的表达量，从而促进血管新生[19]。此外Barile等研究显示心脏祖细胞分泌的外泌体内miR-210及miR-132高表达，且miR-210通过抑制其目标基因ephrinA3及 PTP1b减少心肌细胞凋亡，miR-132可下调目标基因 RasGAP-pl20表达，增强血管内皮细胞增殖能力[30]。

4 展望

外泌体因为细胞来源的不同蛋白质和miRNA组成亦不同[12,13]，且易通过流式细胞术、蛋白印迹和实时定量PCR被快速获取[31,32]。这些生物特性为外泌体的体外研究、临床应用提供了可能。其中外泌体来源的miRNA在心肌梗死的早期诊断、心肌保护及移植治疗方面均有重要作用，相信通过更多深入的研究，外泌体来源miRNA在心肌梗死后的心肌修复会应用于临床治疗，造福患者。