甘蔗果酒多酚含量测定的不同方法对比研究

胡瑞云，沈石妍，王智能，杨柳，李艳芳，郭家文，应雄美

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南 开远661699）

甘蔗是我国最主要的糖料作物之一，含有丰富的营养成分。蔗茎含有15%～25%蔗糖分（对蔗汁），蔗汁中含有0．20%～0．32%（对蔗汁干固物）蛋白质（有蛋白质、氨基酸及酰胺等）总含量，主要以谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸等存在；其中还含有多达30多种的无机物元素，主要是钾、钠、镁、钙、硅、磷、硫、氯等；总有机酸含量0．05%～0．15%（占甘蔗总量）的乌头酸、苹果酸、草酸、柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸等无氮有机酸；色素类主要有：叶绿素、蔗黄素、胡萝卜素及花青苷等色素，约0．17%。甘蔗中的多酚类物质主要是蔗节中的花青苷中的酚羟、甘蔗纤维中的蔗黄素以及原儿茶酸衍生出来的单宁[1-2]。

甘蔗中已被鉴定的酚类物质有20多种低分子量的酚酸、黄酮类物质以及一些高分子量的聚合物（如单宁）。近年来天然抗氧化剂—多酚类化合物的抗氧活性得到多方的关注，这类物质既可用作为食品添加剂使用，又对人体有良好的保健功能，如能够预防心脑血管疾病，消除人体过多的自由基、抗癌、抗衰老、提高机体的免疫力[3]。Tesfaye等[4]研究发现甘蔗原汁中的非糖提取物具有较高的抗氧化活性，抗氧化活性成分主要是一些多酚类物质。涂斌等[5]研究表明，多酚以大量的酚羟基作为氢供体，对多种活性氧起消除作用，使其具有抗氧化能力。郑凤锦等[2]研究认为：甘蔗果酒和甘蔗原醋对DPPH·、·OH、O2·均有较强的清除作用，且随样品体积的增加而逐渐增强，清除率均高于Vc和没食子酸，同时对NO2-也有一定的清除作用，对金属离子有良好的螯合作用，可作为新型保健产品进行开发。

目前测定多酚的常用方法有分光光度法、液相色谱法、滴定法、红外吸收光谱法、电化学分析法和分光光度法（包括紫外分光光度法、原子吸收分光光度法等）。其中，高锰酸钾滴定法的滴定终点较难观察，测定灵敏度较低；香草醛法和铁氰化钾可见分光光度法对测定条件要求严格，稳定性较差，干扰因素较多，易出现沉淀；液相色谱法通常是对单个或多个具体组分进行定性和定量，对复杂多酚组成的总酚含量无法测定[6-8]。

本实验拟采用Folin-Ciocalteu比色法（F-C法）、Folin-Denis比色法（F-D法）及紫外分光光度法3种测定方法[3，8-14]进行比较，考察最适宜的测定方法，为甘蔗果酒多酚测定方法的准确性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

甘蔗果酒，云南省农科院甘蔗研究所开发产品；没食子酸、磷钼酸、茶多酚，山东亚西化学股份有限公司；无水碳酸钠，广东省化学试剂工程技术研究开发中心；钨酸钠，天津市化学试剂四厂；磷酸，天津风船化学试剂有限公司；UV-5800 PC紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；F-C显色剂，上海源叶生物科技有限公司。

F-D显色剂配制：依次加入50g钨酸钠、10g磷钼酸、375mL水、85%磷酸25mL于烧瓶中，水浴回流2h，冷却后定容500mL棕色瓶中保存。

1.2 方法

1.2.1 F-C法测定多酚含量 F-C法是F-D法的改进方法，是基于多酚羟基结构具有较强的还原性，可以通过它还原一些金属离子，利用金属离子可与有机试剂发生络合显色反应而间接地测定多酚的含量。是利用显色剂F-C试剂的钨钼酸将多酚化合物定量氧化，自身被还原（W6+变为W5+）生成蓝色的化合物，反应液颜色的深浅与多酚含量呈正相关的比色测定方法[14]，Na2CO3溶液是显色的支持介质。通过前期的预实验得到F-C试剂最佳显色方案为：吸取样液适量，加入1．5mL F-C试剂于25mL容量瓶中，加入10%Na2CO3溶液2mL，加纯水定容至25mL，放置60min，以试剂空白为参比，在最大吸收波长处测定吸光度，依据标准曲线计算试样中的总多酚含量。

1.2.2 F-D法测定多酚含量 F-D法也是基于碱性条件下利用显色剂F-D试剂与酚类化合物反应显色的比色测定方法，Na2CO3溶液是显色的支持介质。通过预实验得到的F-D试剂最佳显色方案为：吸取样液适量，加入2．5mL F-D试剂于25mL容量瓶中，加入饱和Na2CO3溶液2mL，50℃水浴10min，加纯水定容至25mL，有少许混浊，滤纸过滤，以试剂空白为参比，在最大吸收波长处测定吸光度，依据标准曲线计算试样中的总多酚含量。

1.2.3 紫外分光光度法测定多酚含量 紫外分光光度分析法是基于多酚的不饱和结构，在320～380 nm（吸收带I）和200～270 nm（吸收带Ⅱ）两个区域有深度吸收峰[15]，该吸收峰的峰值与多酚类物质的含量正相关，因此，可通过测定吸光度值来计算多酚类物质的含量。测定方法为：吸取样液适量，加纯水定容25mL，以纯水空白为参比，在最大吸收波长处测定吸光度，依据标准曲线计算试样中的总多酚含量。

2 结果与分析

2.1 F-C法测定多酚含量

2.1.1 最大吸收波长确定 分别吸取50μg/mL没食子酸标准溶液1．5mL和甘蔗果酒0．1mL于两个25mL容量瓶中，然后按照F-C法最佳显色方案对试样进行显色，在350～1100nm波长区间扫描，确定最大吸收波长。从图1可以看出，没食子酸和甘蔗果酒均在755nm波长附近有最大吸收峰，选择755nm为测定波长。

2.1.2 建立没食子酸标准曲线 分别吸取50μg/mL没食子酸标准溶液0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mL 于 25mL 容量瓶中， 按照 F-C 法最佳显色方案显色定容，于755nm下测定吸光度，得到没食子酸标准曲线（图 2），回归方程为 y=0．1144x+0．015，R2=0．9978，说明在≤8．0μg/mL 范围内多酚浓度与吸光度线性关系良好。

2.1.3 样品中多酚含量的测定 重复性实验：对甘蔗果酒多酚含量进行6次重复测定 （表1），6组测定数据多酚含量平均值0．6146mg/mL，SD=0．032%，RSD=0．52%，低于 2%，说明分析操作过程准确。

精密度实验：对一组甘蔗果酒显色液重复测定吸光度6次，吸光度值分别为 0．2955、0．2958、0．2956、0．2955、0．2955、0．2954， 测定吸光度稳定，说明显色反应稳定可行。

加标回收实验：吸取0．1mL甘蔗果酒样液共6组，分别加入50μg/mL没食子酸标样1mL，显色测定吸光度，6次加标回收试验的平均回收率为104．84%（表 2），SD=0．37%，RSD=0．36%， 低于2%，说明分析操作过程稳定、准确，具有较高的准确性和精密度。

2.2 F-D法测定多酚含量

2.2.1 确定最大吸收波长 吸取50μg/mL没食子酸标准溶液1．5mL，吸取待测样液甘蔗果酒0．1mL，于两个25mL容量瓶中，然后按照F-D法最佳显色方案对试样进行显色，在350～1100nm波长区间扫描，确定最大吸收波长。

从图3可以看出，没食子酸和甘蔗果酒均在735nm波长处有最大吸收峰，选择735nm为测定波长。

2.2.2 建立没食子酸标准曲线 分别吸取50μg/mL没食子酸标准溶液0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mL 于 25mL 容量瓶中，按照 F-D 法最佳显色方案显色定容，于 735nm 下测定吸光度，得到没食子酸标准曲线 （F-D法）如图4所示，回归方程为y=0．0896x+0．0148，R2=0．9975， 说明在≤8．0μg/mL 范围内多酚浓度与吸光度线性关系良好。

2.2.3 样品中多酚含量的测定 重复性实验：对甘蔗果酒多酚含量进行6次重复测定 （表 3），6组测定数据多酚含量平均值 0．5349mg/mL，SD=0．0038%，RSD=0．71%，低于 2%，说明分析操作过程准确。

精密度实验：对一组甘蔗果酒显色液重复测定吸光度6次，吸光度值为 0．2087、0．2085、0．2088、0．2087、0．2091、0．2086，测定吸光度稳定，说明显色反应稳定可行。

加标回收实验：吸取0．1mL甘蔗果酒样液样共6组，各加入50μg/mL没食子酸标样1mL，显色测定吸光度。6次加标回收试验的平均回收率为102．50%（表 4），SD=3．42%，RSD=3．34%， 略高于2%，说明分析操作过程尚缺一定的准确性和精密度。

2.3 紫外分光光度法测定多酚含量

2.3.1 确定最大吸收波长 吸取50μg/mL没食子酸标准溶液1．5mL，待测样液甘蔗果酒0．1mL，于两个25mL容量瓶中，加纯水定容，在190～400nm波长区间扫描，确定最大吸收波长。

从图5可看出：没食子酸在紫外光区210nm和260nm处有两个吸收峰，甘蔗果酒在紫外光区200nm和265nm处有两个吸收峰显现，选择没食子酸最大吸收波长210nm为测定波长。

2.3.2 建立没食子酸标准曲线 分别吸取50μg/mL没食子酸标准溶液0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mL 于 25mL 容量瓶中， 纯水定容 25mL，于210nm下测定吸光度，得到没食子酸标准曲线（紫外分光光度法）如图6所示，回归方程为 y=0．1504x+0．0119，R2=0．9995，说明在≤8．0μg/mL 范围内多酚浓度与吸光度线性关系良好。

2.3.3 样品中多酚含量的测定 重复性实验：对甘蔗果酒多酚含量进行6次重复测定 （表 5），6组测定数据多酚含量平均值 1．2040mg/mL，SD=0．0126%，RSD=1．045%，低于 2%，说明分析操作过程准确。

精密度实验：对一组甘蔗果酒显色液重复测定吸光度6次，吸光度值分别为 0．3724、0．3715、0．3733、0．3724、0．3716、0．3720，测定吸光度稳定，说明显色反应稳定可行。

加标回收实验：吸取0．05mL甘蔗果酒样液样共6组样，分别加入50μg/mL没食子酸量标样1mL，纯水定容，测定吸光度，6次加标回收试验的平均回收率为 103．43%（表 6），SD=0．651%，RSD=0．629%，低于2%，说明分析操作过程稳定、准确，具有较高的准确性和精密度。

2.4 3种多酚测定方法对茶多酚标准液的回收率

吸取0．069mg/mL茶多酚标准溶液，分别用F-C法、F-D法、紫外分光光度法测定多酚含量。从表7看出：F-C 法和 F-D 法测定茶多酚标准溶液平均含量 0．0420～0．0422mg/mL，平均回收率 60．86%～61．15%；紫外分光光法测得结果分别为0．0689mg/mL、99．80%；3种测定方法中除F-D法的RSD值（4．56%）高于2%，其余两种方法的RSD值（0．98%、1．17%）均在2%以内，说明分析操作过程稳定、可靠。

从表8数据对比看出：F-C法、F-D法测定已知含量为0．069mg/mL茶多酚标准溶液时，回收率均在61%左右，紫外分光光度法测定回收率为99．80%；测定未知含量的甘蔗果酒时，F-C 法、F-D 法测定值为 0．6146mg/mL、0．5349mg/mL，紫外分光光度法测定值为1．2040mg/mL。

3 结论

通过3种多酚测定方法的对比，结果显示：⑴测定含量较纯的多酚物质，可采用紫外分光光度法直接测定法，无须显色剂显色，成本低、省时间，回收率可达99%以上；⑵测定组分复杂的多酚物质，宜采用显色剂将酚类物质显色，在可见光区测定；⑶Folin-Ciocalteu比色法、Folin-Denis比色法测定茶多酚回收率在61%左右。⑷Folin-Denis比色法测定过程中，使用饱和Na2CO3溶液显色，浓度较高，有混浊现象产生，需用滤纸滤后测定吸光值，稳定性比Folin-Ciocalteu比色法略差。

4 讨论

从图7看出：多酚（以没食子酸计）在紫外光区210nm、260nm处有两个吸收峰值，多酚（以茶多酚计）在紫外光区205nm、275nm处两个吸收峰值，黄酮（以芦丁计）在195nm、255nm、355nm处有3个吸收峰，而甘蔗果酒在紫外光区虽然也有2个峰值但是峰值不是明显，应该包含有多种成分的物质。实验显示，福林-酚比色法和紫外分光光度法测定多酚含量的方法准确度、精密度、加标回收率均在可接受范围内，均可用于多酚含量的测定，但福林-酚比色法和紫外分光光度法测定甘蔗果酒多酚含量存在较大差异。邓刚等、卜彦花等[12-13]均在测定多酚含量的比较研究中发现两种方法所测多酚含量具有较大差异。福林-酚比色法检测成本相对较高，紫外分光光度法检测成本低、操作简单、重复性好、精密度高，但因其他植物的代谢产物在此波段也有紫外吸收，例如酚酸类、木质素类等，导致直接紫外光光度法测定专属性较差[16]。

实验显示，直接紫外分光光度法测定回收率最高，这与酚类物质在紫外光区有特征吸收有关，对于较为纯净的酚类物质，该法能较准确地测定含量；对于组分较为复杂的样品，在多酚的特征吸收波长处，不排除其它物质也有吸收，从而干扰了酚含量的测定，这种干扰的程度是无法预知的，因此直接紫外分光光度法测定纯化过的多酚物质会比较适宜，测定杂质含量较多的多酚物质不太适宜。