微囊化转VEGF基因成肌细胞在裸鼠的转归研究

高崧瀛 孙健 黄巍 姜月红 李冰 单静 孙洋 王锋 汤维波

（1黑龙江省医院整形颌面外科 黑龙江 哈尔滨 150000）

（2哈尔滨医科大学附属第四医院体检中心 黑龙江 哈尔滨 150000）

（3黑龙江省医院 黑龙江 哈尔滨 150000）

微囊化技术具有免疫隔离作用，它能使微囊内的细胞不受免疫排斥的影响，同时机体内小分子营养物质可自由通过微囊，为囊内细胞提供营养。有实验研究表明微囊化与否细胞VEGF分泌情况无显著差异[1]。微囊化转VEGF基因成肌细胞在一定时期内分泌VEGF，对组织的成活或再生有一定作用[2]。微囊化材料的不同，可使微囊的崩解时间不同，我们应用于改善皮瓣的微囊只需要3～4周持续存在，能稳定分泌VEGF即可，移植皮肤或皮瓣成活后不再需要持续的、外源性的VEGF分泌。我们应用的海藻酸盐制备的微囊可持续2～3个月崩解，但其是否有部分长期存在，是否能较长时期内持续分泌VEGF，从而诱发机体肿瘤或其他显著异常情况的风险，尚无文献报道。本实验应用裸鼠进行此项研究结果报道如下。

1.材料与方法

1.1 材料

实验用BALB裸小鼠，共30只，（雌雄各半,4～6周龄，18～20g），购于长春实验动物中心。置于无特定病原体（SPF）环境中饲养，（恒温25～27℃，恒湿45～50%），饮用水及食物均经灭菌。

1.2 方法

1.2.1 （1）将冻存的pcDNA6/HisA-VEGF质粒转染的转VEGF基因成肌细胞进行解冻、复苏。加入含有血清DMEM，放入37℃细胞培养箱中培养，并进行传代、扩增。（2）微囊化过程，将1g海藻酸钠加入到100ml MilliQ水中，涡旋使使部分海藻酸盐溶解，然后旋转器上过夜。应用MilliQ水配制氯化钡溶液，浓度为30mmol/L。紫外灭菌。将转VEGF基因成肌细胞胰酶消化，然后转移入一50ml falcon试管中，500rpm离心5min，然后弃去上清液。以20ml 0.9%NaCl重悬沉淀，500rpm离心5min，然后弃上清。重复上述步骤。应用微囊发生器进行微囊化，调节参数（氧气流量为8L/min，氧气压力100kpa）。以含有DMEM的培养瓶悬浮微囊化转基因成肌细胞，在37℃/5%CO2孵箱中培养。

1.2.2 随机化将实验动物裸鼠分成实验组和对照组两组，每组15只。将实验组应用微囊化转VEGF基因成肌细胞0.1ml注于其背部皮下，对照组应用未进行微囊化的等量的细胞悬液进行相同位置注射。

1.2.3 观察指标与方法 3个月后进行背部组织HE染色检测微囊是否存在。外源性VEGF检测：取1g注射部位软组织，提取总VEGF蛋白。因该实验所用的成肌细胞已转染携带6his-tag,故通过镍柱纯化可得到外源性VEGF蛋白，进行Western blot特异性目的蛋白检测（抗体由美国Pierce公司提供，以操作方法按说明书进行），PVDF膜洗涤显色后，固定，晾干。应用扫描仪扫描得到结果。裸鼠重要脏器解剖检测。

2.结果

2.1 在40天时，对照组裸鼠意外死亡1只，给予重要脏器

解剖检查，未见异常发现，未进行其他项目检测。给予排除此实验项目。

2.2 微囊观察

注射区域标记部位切取组织，经显微镜下观察，未发现微囊存在，未见组织异常增生，未见新生的异常血管，未见局部肿瘤样结构，表面皮肤完好。

2.3 外源性VEGF检测

未检测到外源性VEGF蛋白。

2.4 解剖检查

二氧化碳安乐死方法处死动物，对裸鼠皮肤、肺部、肝脏、胰腺、胃肠等解剖，进行大体及显微镜下检查，未发现任何肿瘤样结构，未见明显血管异常增生。

3.结论

通过微囊化组和实验对照组观察结果显示，实验组微囊崩解，实验组及对照组均未见外源性VEGF分泌，未见裸鼠肿瘤发生。

4.讨论

海藻酸盐制备的微囊在体内的存在时间较短，恰好可被应用于辅助植皮或皮瓣成活等应用的时间要求。这样，可减少因为微囊化细胞持续存在，能够持续分泌VEGF，从而增加诱发肿瘤的风险，但此方法的安全性也需证实，故设计此实验，通过本实验可初步除外其远期诱发肿瘤或血管增生性疾病的发生。本实验将未进行微囊化的转VEGF基因成肌细胞悬液作为对照组，可帮助了解微囊化免疫隔离对VEGF持续分泌的影响，未进行微囊化的VEGF也可能存在一定时期内持续分泌VEGF可能，故也设计在实验中，因实验样本较少，且其他组如盐水对照、空微囊等无明显致瘤风险，故未设置其他组作为实验对照。目前研究认为血管的发生过程对于肿瘤的生长和转移起着重要作用，VEGF在血管发生中起着重要的调节作用[3]。有研究表明，VEGF参与肿瘤进程并不局限于促进血管生成和增加血管通透性。VEGF可以与肿瘤细胞表面的受体相结合激活下游信号通路，直接参与肿瘤干细胞形成、肿瘤发生以及肿瘤迁移等过程，VEGF还可以通过调控miRNA参与炎症反应。但多大剂量、作用时间与诱发肿瘤的相关性，以及外源性VEGF分泌等对内源性VEGF的影响等尚需进一步研究。