PCR技术在猪肉中微生物检测的应用分析

□ 巩长海 江苏权正检验检测有限公司

食品安全关系着人们的身体健康、社会经济的有序发展以及社会的和谐稳定，保障食品安全是全社会、全人类的共同责任。食品安全中最主要面临的问题为食源性疾病，即通过摄食进入人体的有害物质引发的一类疾病，包括食物中毒、肠道感染、寄生虫病以及有害的化学物质引发的疾病。

我国每年消费大量的猪肉，作为居民副食品，猪肉的消费占肉类总消费比重的50%以上。但最近几年，关于猪肉安全问题的事件层出不穷，近十几年来，猪肉安全问题事件高达700多起，50%以上的食品安全事件是由违规使用瘦肉精、二噁英等化学品引发的，还有一部分来源于物理性风险。全世界每年有70%的食源性疾病患者是由致病微生物引起的。因此，微生物是引发是源性疾病的根源，在猪肉进入市场之前，就有必要对其进行致病微生物检测，从而减少食品安全问题事件的发生。

目前，检测猪肉中微生物的主要技术有PCR技术、DNA探针法、基因芯片等。传统的检测技术存在检测效率低而成本高的弊端，使用受到了限制。PCR技术因高特异性、高灵敏性和简便快捷等优点成为其中一种最常用的检测方法。

1 PCR微生物检测技术的原理

PCR技术主要是由变性、退火、延伸3个热循环步骤构成，即在95℃高温下，DNA双链受热变性为两条DNA单链，在37～55 ℃的低温下，两条寡核苷酸引物与DNA单链结合，形成部分双链，然后以单核苷酸为原料，沿DNA链从5’端向3’端延伸，合成DNA新链。这样，每个双链的DNA模板经过变性、退火、延伸3个步骤的热循环之后，形成了两条双链DNA分子，如此循环往复。

2 PCR技术在食源性微生物检测中的应用

2.1 PCR技术检测猪肉中的沙氏菌

沙氏菌占美国食源性疾病的30%，沙氏菌病原体也是引发我国内陆地区食源性疾病的首要病菌。沙氏门菌主要存在于猪肉中，所以对猪肉中的沙氏菌进行快速而有效的检测可以有效防止沙氏菌引起的食物中毒。研究者王静等人发现，在脱氧胆酸钠和叠氮溴化丙锭（PMA）的共同作用下，可以大幅度地抑制沙氏菌死菌DNA的PCR扩增，活菌DNA的扩增不受影响。把叠氮溴化丙锭（PMA）与微滴数字PCR技术相结合，可以针对性地对猪肉中的沙氏菌进行有效检测。

2.2 PCR技术检测猪肉中的大肠杆菌

肠出血性大肠杆菌可以引发肠炎和出血性腹泻，又被称为大肠埃希氏菌。其中最主要的菌型是大肠杆菌，它是一种新型的肠道致病菌，是全世界公认的人兽致病微生物，主要寄生在猪、牛、羊等动物中。国内研究者针对大肠杆菌的菌体抗原基因、鞭毛抗原基因、溶血素基因、紧密黏附素基因和和志贺祥毒素基因的序列，设计了6对特异性的引物和探针，快速、特异性的检测大肠杆菌。

2.3 PCR技术检测猪肉中金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌可以引发动物和人体的化脓感染，产生的肠毒素可以造成食物中毒，肠毒素具有极高的热稳定性，在几百摄氏度的高温下也不会失活，所以，即使感染的食物经过高温烹煮仍然存在致病的风险。经过市场检测，生猪肉中金黄色葡萄球菌的检出率接近20%，应引起食品监管部门的高度重视。国内研究者李苗云等人把金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因作为靶基因，再与BP平板计数法相结合，在20℃条件下PCR荧光测定生猪肉中的金黄色葡萄球菌。实验结果显示，在稳定期之后传统平板计数法低于荧光测定。

2.4 PCR技术检测猪肉中的单核李斯特菌

李斯特菌是一种单核细胞增生菌，也是一种易引发人畜共患的食源性病菌。单核细胞增生菌具有严重的致病性，可以引发败血症、脑膜炎等。该病菌在5℃左右的低温下仍然可以生长和繁殖，所以大量存在于未杀菌的冷藏食品中。国内研究者李丹丹用iap基因作为靶基因，合成引物和探针，用实时荧光定量的PCR快速检测方法，灵敏度为6.5CFU/mL。国外研究者采用了RT-PCR法检测低温冷冻的猪肉中的单核李斯特菌，省掉了预富集的步骤，与其他几十种菌株没有扩增信号，而且特异性良好。

3 结语

目前，PCR技术在食源性致病微生物、转基因成分以及动物源成分检测中得到了非常广泛地应用。该技术一旦被推广使用，将会大大缩短检测时间，提高检测效率，食品检测水平也随之提高。但是，PCR技术也存在一定的缺陷：如果致病微生物发生高度变异，会使检测结果出现假阳性；用于生成标准曲线的样品不同，结果没有参考价值。PCR技术可以对猪肉中的微生物进行定量检测，还可以应用拓展到更多的食品安全领域。