骨痹舒片中马钱子碱和士的宁在大鼠体内的药动学研究

张景姣，杨艳娇，祁利平，董艳艳，张健，李瑞柯，刘雅敏

【摘 要】目的：以制馬钱子粉为参照，研究骨痹舒片中马钱子碱和士的宁在大鼠体内的药动学特征。方法：大鼠单次灌胃给予骨痹舒片和制马钱子粉，采用尾静脉采血技术，以盐酸克伦特罗为内标，超高液相色谱-质谱联用法测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁浓度，DAS 3.0软件计算药动学参数。结果：骨痹舒片中马钱子碱和士的宁的tmax分别为27.5 min、37.5 min，Cmax为5.467 ng·mL-1、22.483 ng·mL-1，AUC0→t为879.501 ng·min-1·L-1、4 105.627 ng·min-1·L-1，t1/2α为25.849 min、30.6 min，t1/2β为285.299 min、154.2 min；CL/F为4 205.938 L·min-1·kg-1、654.955 L·min-1·kg-1。结论：马钱子碱和士的宁在大鼠体内的药动学过程均符合二房室模型。两者在骨痹舒片中具有快吸收、快分布、快消除的药动学特征。与制马钱子粉相比，骨痹舒片中马钱子碱的生物利用度增加59.9倍，士的宁的生物利用度增加27.0倍，且吸收和消除速度均显著高于制马钱子粉，提示骨痹舒片中其他配伍药味或制剂工艺对制马钱子的体内过程有影响。临床给药时，若给药剂量过高，会较快出现药效及毒性反应，但药效维持时间较短。

【关键词】 马钱子碱；士的宁；骨痹舒片；药动学；超高液相色谱-质谱联用法；大鼠

Pharmacokinetic Study on Brucine and Strychnine in Gubishu Pian（骨痹舒片）in Rats

ZHANG Jing-jiao，YANG Yan-jiao，QI Li-ping，DONG Yan-yan，ZHANG Jian，LI Rui-ke，LIU Ya-min

【ABSTRACT】 Objective：Take Maqianzi powder as reference to make a pharmacokinetic study on brucine and strychnine in Gubishu Pian（骨痹舒片）in rats.Methods：Rats were given intragastric administration of Gubishu Pian and processed Maqianzi powder，collecting blood from tail vein.With Clenbuterol as the internal standard，UPLC-MS/MS was used to determine the concentrations of brucine and strychnine in plasma of rats.Software DAS 3.0 was used to calculate pharmacokinetic parameters.Results：In Gubishu Pian，the parameters of brucine and strychnine were as follows：tmax（27.5 min，37.5 min）；Cmax（5.467 ng·mL-1，22.483 ng·mL-1）；

AUC0→t（879.501 ng·min-1·L-1，4 105.627 ng·min-1·L-1）；t1/2α（25.849 min，30.6 min）；t1/2β（285.299 min，

154.2 min）；CL/F（4205.938 L·min-1·kg-1，654.955 L·min-1·kg-1）.Conclusion：The pharmacokinetic processes of brucine and strychnine in rats in vivo are in line with the two compartment model.Both of them have the pharmacokinetic characteristics of fast absorption，fast distribution and fast elimination in Gubishu Pian.Compared with processed Maqianzi powder，the bioavailability of brucine in Gubishu Pian has increased by

59.9 times，the bioavailability of strychnine has increased by 27.0 times，and the absorption and elimination rates were significantly higher than that of processed Maqianzi powder，which suggests that other compatible medicinal in Gubishu Pian or other preparation technologies have effects on the process of processed Maqianzi in vivo.In clinical administration，high dosage of it will cause quick drug efficacy and toxic reaction，with short duration.

【Keywords】 brucine；strychnine；Gubishu Pian（骨痹舒片）；pharmacokinetics；UPLC-MS/MS；ratsendprint

骨痹舒片是治疗类风湿关节炎的中药医院制剂，由制马钱子、田三七、络石藤等10味中药组成。前期研究表明，骨痹舒片能够显著减轻软骨破坏，延缓关节软骨退变[1]，促进软骨细胞增殖[2]。《医学衷中参西录》记载，马钱子“其毒甚烈，开通经络，透大关节之力，实远胜于它药也”，是中医治疗痹证的要药。其所含的生物碱成分马钱子碱和士的宁占马钱子总生物碱的80%[3]，两者分子量低，脂溶性好，极易跨膜吸收[4]，既是有效成分亦是毒性成分，主要对神经系统、免疫系统及肾脏产生毒性作用[5]。士的宁口服致死量为30～100 mg[6]，

马钱子碱口服毒性是士的宁的1/71[7]，且治疗剂量和中毒剂量接近。因此，掌握骨痹舒片中士的宁和马钱子碱的体内经时变化规律，对安全合理用药极为重要。本实验采用大鼠灌胃给药，尾静脉采血技术，超高液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS/MS）[8]测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁的血药浓度，研究其在大鼠体内的药动学特征及药动学差异，为临床应用提供参考依据。

1 实验材料

1.1 仪 器 超高效液相色谱-三级四级杆质谱联用仪（Waters Acquity-TQDetecher）；Agela Technologies Bonshell ASB C18色谱柱（2.1 mm× 100 mm，2.7 μm）；高速离心机（H-1600，江东仪器）；DC-24型氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；分析天平（Type：NewCL/Fassic MF.Model：MS150DU）。

1.2 药品与试剂 盐酸克伦特罗、马钱子碱、士的宁（四川维克奇生物科技有限公司，生产批号分别为120075-201604，130718-201605，130765-201608）；骨痹舒片（河南风湿病医院提供，生产批号20160306，马钱子碱含量0.51 mg·g-1、士的宁含量0.69 mg·g-1）；制马钱子粉（河南风湿病医院提供，生产批号20160319，马钱子碱含量

4.14 mg·g-1、士的宁含量12.47 mg·g-1）；甲醇、乙腈（色谱级，赛默飞世尔科技有限公司）；甲基叔丁基醚（国药集团化学试剂有限公司，生产批号20160721）；其他试剂为分析纯，水为超纯水。

1.3 实验动物 健康SD大鼠12只，雌雄各半，体质量（180±20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物许可证号：SCXK（鲁）20140007。

2 方法与结果

2.1 UPLC-MS/MS分析方法

2.1.1 色谱条件 采用Agela Technologies Bonshell

ASB C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流动相

为乙腈：体积分数为0.15%的甲酸溶液（40∶60），柱温35 ℃，流速0.1 mL·min-1。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子源，选用正离子。工作参数：Capillary（KV）3.50；Extractor

（V）4.00；Source Temperature（℃）110；Desolvation

Temperature（℃）300；Cone Gas Flow（L/Hr）50，

Desolvation Gas Flow（L/Hr）300；Gas Cell Pirani Pressure（mbar）3.26 e-3。采用多反应离子监测（MRM）扫描方式，用于定量分析的离子分别为：马钱子碱M/Z[M + H]+ 395.22→243.97，Cone：64 V。Collision Energy：36 V。士的宁M/Z[M + H]+ 335.14→183.96，Cone：70 V。Collision Energy：38 V。盐酸克伦特罗M/Z[M + H]+ 277.11→202.87。Cone：26 V，Collision Energy：18 V。测定结果见图1，显示血浆中的内源性物质不干扰化合物的测定。

2.2 溶液配制 精密称取马钱子碱及士的宁对照品适量，加甲醇配制成两者质量分数分别为

1000 ng·mL-1、2050 ng·mL-1的混合对照品溶液。另精密称取盐酸克伦特罗对照品适量，加甲醇配制成质量分数为32.1 ng·mL-1的内标溶液，均放于

4 ℃冰箱保存，备用。

2.3 血浆样品处理 吸取100 μL大鼠血浆置于Ep管中，加入0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液及内标溶液各20 μL，涡旋30 s；再加入2.5 mL甲基叔丁基醚，涡旋混合3 min，离心机以12 000 r·min-1离心5 min，取上清液2 mL，氮气吹干，100 μL流动相溶解，涡旋1 min；离心机以12 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液进样，即得。

2.4 工作曲线的建立 精密吸取马钱子碱和士的宁混合对照品溶液适量，加甲醇稀释成马钱子碱的质量分数为0.074，0.148，0.594，1.188，2.375，4.750，9.500，19.000 ng·mL-1，士的宁的质量分数为0.198，0.397，0.793，3.172，6.344，12.687，25.380，50.750 ng·mL-1的对照品溶液。取大鼠空白血浆100 μL，按2.3項下方法操作，每一质量分数进行双样本分析，标准曲线采用加权（W = 1/X2）最小二乘法进行回归运算，以待测物与内标峰面积比值（Y），对待测物浓度（X）进行线性回归，求得马钱子碱回归方程Y = 0.265 3X + 0.029 6，r2 = 0.993 0；

士的宁方程Y = 0.652 1X + 0.094 8，r2 = 0.994 9。表明马钱子碱在0.074～19.000 ng·mL-1，士的宁在0.198～50.750 ng·mL-1的范围内线性关系良好，最低定量质量分数分别为0.074ng·mL-1，0.198 ng·mL-1。endprint

2.5 药动学研究 取SD大鼠12只，随机分成2组，每组6只，禁食12 h，自由饮水。2组均按马钱子碱0.24 mg·kg-1的剂量分别给予骨痹舒片及制马钱子粉，采用大鼠断尾取血技术，各组于灌胃前和灌胃后5，10，15，30，45，60，90，120，180，300，420，540 min取血0.2 mL，然后按2.3项下方法处理后进样分析，时间-血药浓度测定结果见表1。以采血时间为横坐标，血药浓度为纵坐标，绘制时间-血药浓度曲线，结果见图2、图3。采用DAS 3.0软件计算两者的药动学参数，并进行智能化分析判断其房室模型，结果见表2。

结果显示，大鼠灌胃给予骨痹舒片和制马钱子粉后马钱子碱和士的宁在大鼠体内的药动学过程均符合二房室模型。将两者的药动学参数导入SPSS 22.0

软件进行t检验，结果表明tmax、Cmax、AUC及CL/F的差异有统计学意义。

3 讨 论

据相关文献报道，生物样品中马钱子碱和士的宁测定的方法有HPLC[9]、GC[10]、荧光分光光度法[11]、GC-MS[12]和LC-MS/MS[13]。其中LC-MS/MS法由于检测专属性强、灵敏度高，在药动学研究中比较常用。因此，本实验采用UPLC-MS/MS同时测定大鼠血浆中士的宁和马钱子碱两种成分，该方法简单、准确、快捷，是马钱子在体内药动学研究的理想方法。

实验表明，大鼠灌胃给予骨痹舒片和制马钱子粉后马钱子碱和士的宁在大鼠体内的药动学过程均符合二房室模型。两种成分在大鼠体内具有快吸收、快分布、快消除的药动学特征，而且士的宁的达峰浓度远高于马钱子碱，提示在用药时应当对患者的安全耐受剂量进行谨慎探索，寻找患者合适的个体给药剂量。由于该药消除速度较快，为维持有效血药浓度，建议临床使用时可适当缩短给药间隔、增加给药次数；但如何确定安全合理的给药剂量与给药间隔，还有待深入研究。

实验结果显示，骨痹舒片复方中两种生物碱的药动学参数与制马钱子粉相比有显著差异。马钱子碱在骨痹舒片中的tmax、Cmax、AUC0→t、CL/F分别是制马钱子粉的0.7，1.2，1.2，48.3倍；士的宁在骨痹舒片中的tmax、Cmax、AUC0→t、CL/F分别是制马钱子粉的0.9，1.4，2.0，13.4倍。表明与制马钱子粉相比，骨痹舒片中的马钱子碱和士的宁在大鼠体内的达峰时间提前，峰浓度增大，生物利用度增加，吸收和消除速率加快。这种药动学特征提示，骨痹舒片中其他配伍药味或制剂工艺对制马钱子的体内过程会有影响，其影响因素有待深入研究。

4 参考文献

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收稿日期：2017-08-14；修回日期：2017-08-23endprint