microRNA—21调控成骨细胞增殖和凋亡的相关研究

汪凯文 陈德庆

【摘 要】目的：探究microRNA-21对成骨细胞增殖和凋亡的作用。方法：应用PCR技术检测转染后的成骨细胞中microRNA-21的表达水平；应用CCK-8实验检测microRNA-21对成骨细胞增殖能力的影响；应用TUNEL实验检测microRNA-21对成骨细胞凋亡的影响。结果：PCR结果显示，转染microRNA-21 mimics后，成骨细胞中microRNA-21的表达显著升高，而转染microRNA-21 AMO后，成骨细胞中microRNA-21的表达显著降低；CCK-8实验结果表明，microRNA-21 能够显著升高成骨细胞增殖能力；TUNEL结果表明，microRNA-21能够抑制成骨细胞发生凋亡。结论：microRNA-21能够显著升高成骨细胞增殖能力，并抑制其发生凋亡，从而可能参与骨质疏松的发生和发展。

【关键词】miRNA；骨质疏松；成骨细胞；增殖；凋亡

【中图分类号】R968 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0019（2018）20-0-01

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种以骨密度降低、骨微观结构受损、骨量减少、骨强度下降，引起骨脆性及分离度增加的全身代谢性骨骼疾病[1]。骨质疏松患者容易出现胸廓畸形、骨痛和驼背等症状，严重时将发生骨折[2]。骨质疏松的主要发病原因之一是破骨细胞性骨吸收与成骨细胞性骨形成平衡失调[3]。因此，成骨细胞在维持骨平衡和骨代谢中发挥重要功能。MicroRNAs（miRNAs）是一类存在于所有真核细胞、由大约22个核苷酸组成的非编码RNA，具有组织特异性和发育阶段特异性[4]。miRNAs通过和其靶点mRNA特异性结合，使其降解或抑制其翻译，从而调控基因的表达，最终在细胞增殖、分化、凋亡、个体生长发育及疾病的发生与发展等方面发挥重要调控作用[5]。本研究探究microRNA-21对成骨细胞增殖和凋亡的影响，并寻找治疗骨质疏松的关键microRNA，为临床治疗骨质疏松提供新的靶点和方向。

1 材料与方法

1.1 材料 二氧化碳恒温培养箱（Thermo，美国），倒置光学显微镜（Nikon，日本），microRNA-21及阴性对照、所有引物設计和合成（吉玛，中国广州），逆转录仪、PCR仪（罗氏，德国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：人成骨细胞系MC3T3-E1采用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL的青-链霉素的α-MEM培养液中培养，并接种于25 cm2的细胞培养瓶后置于37 ℃培养箱中培养（Thermo公司，美国）。培养24 h后置于倒置光学显微镜（Nikon公司，日本）下观察细胞，待细胞汇合度达到80%-90%时进行细胞传代，传代比例一般为1：2或1：3。

1.2.2 细胞转染：将细胞接种于小皿或96孔板中，当细胞汇合度达到50%-60%，采用细胞转染试剂X-treme进行转染。microRNA-21 mimics和microRNA-21 AMO转染浓度分别为50 nM和100 nM。转染6 h后更换含有10%胎牛血清的新鲜培养液以维持细胞正常生长，转染24 h后进行后续实验。

1.2.3 PCR检测microRNA-21的表达：应用TRIZOL提取样品中总RNA，测定浓度和纯度，待用。参照逆转录试剂盒说明书，使用逆转录仪将RNA逆转录成cDNA，保存于-20℃，待用。在PCR板中分别加入10 μL的SYBR Green，7 μL蒸馏水，2 μL目的基因的引物及1 μL cDNA，总体系为20 μL，在PCR仪上进行PCR扩增。根据CT值，计算microRNA-21的表达情况。

1.2.4 CCK-8实验：将96孔板中的培养液弃净，每孔加入100 μL无血清单纯培养基，并加入10 μL的CCK-8试剂，呈“十”字轻轻晃动培养板，充分混匀后，避光置于细胞培养箱中，孵育4 h后，采用酶标仪检测各组细胞的吸光度值，并计算增殖能力。

1.2.5 TUNEL染色：成骨细胞以1×105/cm2密度接种到小皿中，待细胞汇合度达到40%-50%时，进行转染或加药48 h后，4%多聚甲醛固定细胞后，室温下用穿透液于穿透细胞60 min，PBS清洗三次后加入TUNEL反应混合液，在37 ℃避光湿盒中摇床孵育1 h。PBS漂洗3次后，用封闭液封闭20 min，PBS清洗细胞3次后，用染色液4 ℃摇床孵育过夜。次日，用DAPI染色液孵育20 min，显微镜下观察细胞，并统计结果。

1.3 统计学处理 所有数据均采用Graphpad软件进行统计学处理，并分析差异是否具有统计学意义，*p < 0.05，**p < 0.01和 ***p < 0.001，具有统计学意义。

2 结果

PCR结果显示，转染microRNA-21 mimics后，成骨细胞中microRNA-21的表达显著升高，而转染microRNA-21 AMO后，成骨细胞中microRNA-21的表达显著降低，说明转染效率较高；CCK-8实验结果表明，转染microRNA-21 mimics后，成骨细胞增殖能力显著升高，而转染microRNA-21 AMO后，成骨细胞增殖能力显著降低；TUNEL染色结果说明，转染microRNA-21 mimics后，成骨细胞凋亡比例显著降低，而转染microRNA-21 AMO后，成骨细胞发生凋亡的比例显著升高，说明microRNA-21抑制细胞发生凋亡。

3 讨论

骨质疏松症（ Osteoporosis） 是一种以骨量减少，骨微结构破坏，导致骨脆性增加，骨折危险性增加为特征的全身性代谢骨病。防治骨质疏松症及其并发症已逐渐成为骨科领域亟待解决的严重问题之一。骨组织是重要的结缔组织，起着支撑身体以及保护内脏器官的作用。正常生理条件下，骨微环境中骨组织会发生重建，主要是成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收，正常情况下，这两者处于动态平衡。骨重建过程中的这种平衡被打破将会引起人体病理生理改变，骨质疏松的发病原因是骨吸收速率增加，使骨形成少于骨吸收，最终导致骨总量降低。因此，如何提高成骨细胞生物学功能是治疗骨质疏松的重要靶点。

综上所述，microRNA-21能够显著升高成骨细胞增殖能力，并抑制其发生凋亡，从而可能参与骨质疏松的发生和发展。本研究为临床治疗骨质疏松提供新的靶点和思路，为microRNA应用于治疗骨质疏松提供实验基础。

参考文献

王爱飞，王亮，and 徐又佳，MicroRNAs对骨质疏松症发病机制的研究进展.中国骨质疏松杂志，2018（1）： p.135-140.

倪梦杉，et al.，治疗骨质疏松和骨折何时联用或介入抗骨质疏松治疗.中国组织工程研究，2018.22（4）： p.625-630.