帕金森疾病动物模型的研究进展

张志成，袁 圆，王 璇，宋庆凯，代解杰*(1.昆明医科大学，昆明 650500； .中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118)

帕金森疾病(Parkinson’s disease，PD)是一种由遗传和环境因素相互作用引起的复杂神经退行性疾病，发病机制尚不清楚。典型特征包括运动失常、路易体(Lewy bodies，LB)形成和黑质(substantia nigra，SN)中多巴胺(dopamine，DA)神经元的丧失[1]。PD在疾病的早期阶段有较好的对症治疗方法，但这些治疗方法并不会改变疾病的进程。因此，可以减缓或停止PD进展的干预措施仍是亟需实现的目标。PD动物模型有助于阐明PD病因和发病机制，在新的治疗方法和药物研发中具有重大的应用价值。本文针对主要PD动物模型作一综述。

大体上，PD的动物模型可以分为三类：基于靶向儿茶酚胺能神经元的神经毒素损伤模型、基于PD相关基因的转基因模型以及二者的组合。目前每个模型都是模拟PD的一个或几个病理过程，每种模型都有自己的优点和局限，都不能完全模拟PD病理特点和疾病症状，可以根据实验目的选择合适的实验方案。

1 神经毒素模型

1.1 6-羟基多巴胺模型

6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)不能通过血脑屏障，其结构与DA神经递质相似，对DA质膜转运蛋白具有高亲和力，诱导DA神经元和去甲肾上腺素能神经元变性，通过触发氧化应激相关细胞毒性和小胶质细胞依赖性DA神经元炎症，引起其毒性机制[2 - 4]。

斑马鱼腹侧间脑与人类黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)解剖学相似，Vijayanathan等[5]将6-OHDA神经毒素(25 mg/kg)显微注射到斑马鱼腹侧间脑，3 d后，病理检测显示嗅球、端脑、中脑神经元损伤，并且行为学检测显示运动距离和速度明显下降，成功建立斑马鱼PD模型。Kamińska等[6]将不同剂量的6-OHDA(8、12、16 μg/4 μL)注入Wistar Han大鼠内侧前脑束(medial forebrain bundle，MFB)，研究表明，使用最高剂量的6-OHDA且无地昔帕明预处理可诱发神经和行为学改变，可用于建立晚期PD伴抑郁症模型。Thiele等[7]的研究显示较小的注射体积和较慢的输注速率可确保MFB周围结构的最小损伤，避免损伤小鼠的饮食中心，具有高的造模成功率和低的死亡率。成年大鼠的双侧SNc病变可出现危及生命的吞咽困难、渴感缺乏和运动障碍，所以很少使用。Kostrzewa等[8]采用双侧脑室内或脑池内6-OHDA给予围产期大鼠制作PD模型，该过程不致死、不缩短寿命，大鼠行为正常，可通过高剂量左旋多巴产生的运动障碍来辨别。该模型导致黑质纹状体神经纤维近乎完全破坏(双侧99%)和去神经支配，类似于人类严重PD的神经化学状态，在评估抗PD药物方面具有显著的优势。

狨猴纹状体注射6-OHDA可导致典型的PD运动障碍，SN中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性细胞损失约63%，但无α-突触核蛋白(α-synuclein)表达的报道[9]。Santana等[10]对狨猴MFB单侧多位点给予6-OHDA(4 mg/mL，10 μL)，8周后对侧采用同样处理方法，相比8周前，双侧处理的动物出现更严重且稳定的运动障碍，虽然有一定程度的自发恢复，32周期间总PD评分逐渐下降。表明两阶段神经毒性损伤程序会诱发持续数月的稳定运动症状，该模型适用于PD新疗法的长期评估。恒河猴中6-OHDA全身给药，可建立常见的PD非运动症状——心脏肥大症[11]。

6-OHDA建模可选择纹状体、SN或MFB，6-OHDA所致的纹状体损伤在几周内中度持续，而MFB病变严重并且在1～2周内迅速发展[12]。MFB模型更适合于研究DA神经元死亡的后果，并测试治疗运动症状的治疗策略，而纹状体模型可能更有助于阐明PD的细胞死亡机制，并测试神经保护策略[13 - 14]。

1.2 1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶模型

1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine，MPTP)是脂溶性的，可以快速通过血脑屏障，主要通过氧化损伤和抑制线粒体呼吸链复合物杀死DA神经元[15]。这种模式再现了DA缺乏综合征，而不是DA神经元进行性变性的过程。

小鼠MPTP损伤模型多出现PD运动障碍[16 - 18]，而Zhang等[19]采用雄性C57BL/6小鼠腹膜内注射MPTP[30 mg/(kg·d)]连续5 d，虽然纹状体DA神经元损伤、α-synuclein水平升高且血脑屏障通透性改变，但没有明显的运动缺陷，推测可能是由于去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)系统和DA系统的补偿作用。Dauer等[20]指出黑质纹状体DA含量损失约60%～80%即DA神经元的损失量约40%～60%时，运动症状变得明显。丙磺舒可以避免神经毒素的肾清除并增加毒性代谢物MPP+的水平，使DA神经元产生显著不可逆的损失[21]。研究发现[22 - 23]用MPTP(25 mg/kg)加上丙磺舒(250 mg/kg)制作的C57/black小鼠慢性PD模型在第4周给药后运动障碍表现最明显，而且在5周的慢性方案中，非运动和运动症状逐渐出现，小鼠SNc中会出现典型的PD特征，如α-synuclein沉积物，是进行性PD的有效模型。采用雄性C57BL/6 N小鼠皮下施用低剂量MPTP(20 mg/kg，每周3次)3个月，可建立小鼠慢性PD模型。该模型死亡率低，黑质纹状体DA神经元进行性退化，伴随着持续的神经炎症反应和运动缺陷，类似于PD的缓慢进行性神经变性过程。这种建模方式可能有助于建立不同阶段的PD，更好地了解疾病的病理生理学，可用于测试PD中的神经保护和修复治疗策略[24]。Pain等[25]评估了急性、亚急性和慢性的MPTP雄性C57BL/6小鼠模型，结果显示各组中纹状体DA含量损失一致(约60%)，而TH活性和DA能转运体水平减少取决于MPTP的累积剂量。虽然急性和亚急性中毒小鼠的中脑和海马5-羟色胺水平降低，但似乎不依赖于MPTP注射剂量，这与Rousselet等[26]研究结果一致。

在食蟹猴中，慢性和延长的MPTP给药(0.3 mg/kg，静脉注射，间歇性两年，2岁给药，10年后处死)，在剩余的SN神经元胞体和神经纤维结构中发现α-synuclein积累、磷酸化的α-synuclein免疫反应性，但无典型的LB发现[27]。猕猴连续低剂量[0.1 mg/(kg·d)]MPTP皮下注射14 d后可出现中度PD症状，此后隔日注射一次，4次后猕猴出现不可逆性PD运动症状，且可自主摄食并长期存活[28]。李鹏等[29]对猕猴后小腿皮下静脉缓慢注入MPTP溶液(0.2～0.4 mg/kg，间隔1 d，连续5次)，3个月后评估模型情况。虽然猕猴出现典型帕金森运动症状、TH阳性纤维大量丧失，但未见到LB形成。史良琴等[30]采用恒河猴小剂量、长时间前臂肌内注射MPTP(0.2 mg/kg，45 d)，动物可出现典型行为学症状，且观察到LB形成。但该方法存在时间长，脉冲式给药无法做到慢毒诱导，人为干扰大等因素。Ma等[31]对树鼩连续腹腔注射MPTP[3 mg/(kg·d)]，5 d后出现典型的帕金森运动症状，且纹状体DA和DOPA水平显著降低，脑中α-synuclein mRNA水平升高，提示树鼩可能是研究PD发病机制的潜在动物模型。邓苙等[32]研究指出树鼩MPTP模型与6-OHDA模型相比，PD行为学特征更明显，树鼩的TH阳性神经细胞呈双侧性减少，提示MPTP经腹腔注射是制备树鼩PD模型的理想方法。

与灵长类动物相比，啮齿动物对MPTP毒性的敏感性较低，白老鼠几乎不受MPP+的影响，MPTP限制在黑色小鼠或灵长类的PD动物模型中[8]。急性MPTP给药主要引起DA能神经细胞非凋亡性死亡，而长期施用低至中等剂量的神经毒素导致由凋亡性细胞死亡引起的进行性的神经变性，可以反映PD患者大脑中的细胞分子生物学变化[33]。

2 转基因小鼠模型

转基因模型主要是基于家族性PD相关基因的发现，迄今为止，已经鉴定了15个致病基因和超过25个遗传风险因子[34]，归类为“PARK”基因和“非PARK”基因。已经证明α-synuclein水平过表达，在病理发展中至关重要。

2.1 基因敲除模型

Nuytemans等[35]研究发现PINK1(PTEN-inducedputativekinase1，PARK6)的约30种致病突变与PD相关。然而，小鼠PINK1缺失不会导致明显的表型，迄今为止，开发的PINK1敲除(-/-)和敲低小鼠模型显示轻度的神经退行性变化[36]。Oliveras-Salvá等[37]研究显示重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)2/7载体介导的雌性C57BL/6小鼠SN中PINK1的敲低不会引起行为缺陷或DA细胞死亡、不增强α-synuclein诱导的神经病理学变化，但是在PINK1-/-小鼠中α-synuclein诱导的DA能细胞死亡和磷酸化增强。PINK1-/-小鼠SN中的DA神经元没有丧失，但纹状体中突触可塑性受损[38]，表型仅显示总DA水平的轻微降低[39]。而Glasl等[40]在PINK1-/-C57BL/6 J小鼠中观察到DA细胞的丧失、神经变性增加，表现为PD早期症状。

钙离子非依赖型磷酸酯酶A2, VIa亚型(calcium-independent phospholipase A2, group VIa，iPLA2β)基因突变PLA2G6发生于PD的多种神经疾病中。Blanchard等[41]研究显示，雄性iPLA2β-/-小鼠4个月时，神经病理学变化很小。12个月时，小鼠出现运动障碍、小脑神经元损失和纹状体中α-synuclein积累。15～20个月，该模型仍未出现PD特有的运动特征，仅显示神经炎症和PD相关的神经病理学变化。

Wang等[42]发现tetranectin基因敲除C57BL6/J小鼠(TN-/-)与年龄匹配的WT小鼠相比，12个月时，SNc中具有较少的DA神经元。DAT、二羟苯乙酸水平升高，意味着小鼠纹状体DA能终端的代偿性增加。小鼠运动迟缓、旋转速度变慢，运动功能逐渐恶化，伴有中度至重度肢体僵硬和异常姿势，并且无自发行为恢复。两种基因型老年小鼠(> 18个月)的SN中α-synuclein免疫反应性均增加，但TN-/-小鼠反应更明显，形成LB样物质。老年TN-/-小鼠的纹状体α-synuclein水平显著降低。该模型可能是研究LB形成、检测PD神经保护疗法或其他突触核蛋白病的有价值的模型。

PARK2基因(parkin基因)异常多导致青少年PD综合征。虽然parkin-/-和WT C57BL/6 J小鼠在行为测试中没有差异，parkin缺乏不会引起大量的SN变性或PD症状，但是parkin-/-诱发DA的半衰期延长，影响纹状体的DA释放。幼年parkin-/-小鼠中α-synuclein释放和摄取减少表明DA神经传递早期症状的改变，而在老年parkin-/-小鼠的α-synuclein增强可能反映PD晚期症状前期DA功能的补偿性适应。parkin的遗传缺陷可能导致DA神经元的早发性生理功能障碍[43 - 44]。

转基因小鼠可以在一定程度上模拟与PD类似的一些神经病理学和行为表型。然而，与PD相关大脑区域(如SNc或者蓝斑)的神经元损失，大多数转基因小鼠不会出现，并且病理学和表型的出现通常和细胞死亡一致，迄今为止的基因敲除小鼠都没有代表PD的真实模型[45]。

2.2 病毒载体转基因模型

到目前为止，大多数基因敲除小鼠未能显示出明显的DA能细胞损失和DA依赖性行为缺陷。而通过向脑中靶向输入病毒载体，局部过表达α-synuclein，可以克服这一障碍。人α-synuclein由第4号染色体SNCA基因编码。SNCA基因突变(包括A30P，E46K，G51D和A53T)以及SNCA倍增的特异性突变都与α-synuclein聚集增加相关联，α-synuclein模型有助于阐明与PD相关的基因对DA神经元变性的贡献。

Niu等[46]通过慢病毒(lentivirus，LV)载体在恒河猴卵母细胞中表达A53T α-synuclein，75个胚胎成功孕育出6只转基因猴。虽然转基因猴未出现明显的DA神经元退化及运动症状，但出现了年龄依赖性的、啮齿动物模型中难以模拟的PD非运动性症状——认知缺陷和焦虑。这与PD患者早期疾病阶段非运动性症状一致。该模型对研究人员认识PD早期病理事件和验证PD的治疗靶点是有价值的。Eslamboli等[47]使用rAAV2/5载体在绒猴腹侧中脑中表达WT、A53T α-synuclein。9周后出现运动症状，15周WT组运动偏倚明显，33周后A53T组运动性能逐渐恶化，运动协调错误增加。两组动物纹状体中DA能纤维显著退化，在腹侧中脑区域A53T组比在WT组更突出。两组动物存活DA神经元中都观察到含有α-synuclein聚集体。这在其他啮齿类动物模型中没有观察到，是研究神经保护策略和新药的优秀工具。Van der Perren等[48]向Wistar大鼠SN部位注射携带A53T α-synuclein的rAAV2/7。3周后，接受剂量为3.0E11 GC/mL的大鼠中观察到显著的运动障碍。4周后，注射部位对侧(左)前爪使用率降低了50%，DA实验阳性。32 d后，PET成像观察到DAT结合率降低高达85%。免疫组化显示SN中不溶性α-synuclein阳性聚集体形成。与WT α-synuclein模型和6-OHDA模型相比较，A53T突变诱导的SN中DA细胞进行性死亡和α-synuclein阳性聚集物的形成具有时间和剂量依赖性，小鼠显示出运动缺陷[49]。A53T模型的损伤程度比WT模型更严重[50 - 51]。A53T模型可能是早发性PD的合适模型。

恒河猴(大约8岁)和同年龄野生型C57/B6小鼠(10个月)相比，猴脑中反应性星形胶质细胞和轴突变性的增加，A53T α-synuclein在猴脑中显示比小鼠更严重的年龄依赖性的神经毒性，且A53T α-synuclein的累积和相关病理学发展是年龄依赖性的[52]。Lauwers等[53]采用重组LV载体将WT、A30P或A53T三种α-synuclein突变基因导入Wistar大鼠SN，结果显示神经细胞损伤不明显，5个月时大鼠神经细胞损伤24%～35%。相对于LV载体而言，rAAV载体转导效率可能更好、DA神经元细胞损伤更明显、造模时间更短，AAV载体转导效果优于LV载体[54]。

rAAV的衣壳血清型也是PD模型制作重要的考虑因素。与rAAV2/1相比较，rAAV2/7血清型转导时间更短、DA能细胞损失更多[55 - 56]。AAV1、AAV5和AAV8血清型在SNc中转导效率高于AAV2[57]。rAAV7血清型在小鼠SNc中显示出高水平的α-synuclein表达，并产生了DA神经元的强烈丧失[51]。病毒载体模型动物的种类、品系和年龄在模型制作时也是应该考虑的。据报道[48]rAAV2/9-α-synuclein在C57BL/6小鼠的SNc中产生强烈的DA神经元变性，但其他品系小鼠不产生。提示研究人员在比较基因在rAAV-α-synuclein介导的表型中的作用时，应该在相同的背景下使用同基因品系小鼠。

rAAV-α-synuclein模型没有完全概括在PD患者脑中发现的LB和路易体神经突的特征。虽然α-synuclein似乎定位于过表达α-synuclein的转导神经元中，但是这些聚集体不具有典型LB和路易体神经突的形态学特征。

2.3 转基因与神经毒素联合模型

用AAV载体将α-synuclein基因单侧递送至雄性SD大鼠SN，13周后皮下植入神经毒素鱼藤酮渗透性微型泵。结果发现，大鼠出现进行性运动功能障碍、黑质纹状体神经变性和α-synuclein病理学的经典PD三联征，受损的神经元对鱼藤酮更加敏感。但是，该方法受到鱼藤酮的全身毒性的限制，鱼藤酮的直接大脑内递送可能在长期研究中更有用[58 - 59]。Song等[60]在雄性C57BL/6小鼠的双侧SN中使用rAAV2/1载体过表达WT α-synuclein，8周后进行了亚急性MPTP治疗。发现过表达的α-synuclein诱导黑质纹状体进行性变性，DA神经元对MPTP的敏感性增加。在α-synuclein基因敲除雄性C57BL/6小鼠体内注射6-OHDA导致黑质纹状体通路持续DA消耗，行为参数在两个月内部分恢复[61]。6-OHDA毒性似乎受α-synuclein的影响，但啮齿动物脑内6-OHDA给药导致SN细胞损失却不诱导α-synuclein表达导致的PD样变化[62]。

转基因小鼠是非常强大的工具，可以让研究人员了解分子、细胞和整个组织水平的分子和蛋白质在体内的作用，转基因小鼠和神经毒素两种技术的结合将对于阐述PD分子和细胞机制，有很大的应用价值。

3 小结

MPTP和6-OHDA都是儿茶酚胺神经毒素，广泛用于啮齿类、树鼩、非人灵长类动物等PD模型的创建及相关病理机制研究。6-OHDA通常采用单侧治疗并产生单侧运动障碍，左旋多巴诱导后出现同侧运动不良和旋转行为，容易检测和测量[63]。双侧注射低浓度的6-OHDA可用于认知的研究，因为其产生DA神经元的平衡损失并模拟PD的早期阶段[64]。为了特异性靶向DA神经元，6-OHDA必须与去甲肾上腺素和5-羟色胺转运蛋白抑制剂一起给药[65]。MPTP引起的损伤程度和细胞死亡模式取决于给药方案[66]。MPTP引起的运动障碍可恢复，需要高度挑战性的行为测试来检测。MPTP小鼠模型是测试神经保护剂的有效性的经典模型，但是在神经毒素模型中显示神经保护作用的许多化合物在临床试验中失败[67]。神经毒素模型在神经保护方面缺乏预测能力和不会出现典型LB病理学特征导致研究重点放在强调病理性α-synuclein的PD其他模型上。转基因模型为常见且广泛使用的神经毒素的模型提供了替代方案和补充。基因敲除/敲入模型为相关人员研究确切的分子机制提供了研究工具，这些模型的早期症状学提供了靶向功能障碍途径的可能性，但是该模型实验周期长且对技术要求较高。基于α-synuclein的病毒载体模型具有渐进性质，允许在退行过程的不同阶段进行治疗干预。在AAV-α-synuclein模型中观察到的α-synuclein与PD患者相似，表明存活的神经元保持功能失调状态，这使得该模型在病理机制的研究中特别有用。

理想的PD模型可以模拟人类疾病的损伤分布及其随时间的变化，但目前并没有一个完美的模型能够完全模拟PD所有特征。尽管广泛认为PD是由潜在的遗传学和暴露于环境危险因素引起的，但科学研究中仍广泛使用单一遗传或神经毒素来模拟PD的临床前状态。单一因素的模型在研究病因学、构建和表观有效性方面都受到限制，因此综合因素的PD模型也是值得关注的。

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