ε—聚赖氨酸对尿液中常见细菌的体外抑菌效果及对尿蛋白测定影响的研究

郭国威 许坚锋 陈锦文

【摘要】 目的：了解ε-聚赖氨酸（ε-Poly-L-lysine，ε-PL）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌及铜绿假单胞菌等四种尿液中常见细菌的体外抑菌效果，并探讨其对尿蛋白测定的影响。

方法：使用肉汤稀释法将ε-PL倍比稀释后加入等量细菌悬液中，于35 ℃温箱内24 h后观察ε-PL对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度（MIC）。同时将不同浓度的ε-PL加入尿液中，分析其对尿蛋白测定的干扰。结果：ε-PL溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌及铜绿假单胞菌等尿液中常见细菌的体外抑菌均有明显效果，MIC分别为0.02、0.01、0.04及0.01 mg/mL，其中ε-PL对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果最好；原尿液、加蒸馏水尿液中尿蛋白含量比较，差异无统计学意义（P>0.05）；含不同浓度ε-PL尿液标本中尿蛋白含量均明显高于原尿液，比较差异均有统计学意义（P<0.05），且随着尿液中ε-PL浓度的增加对蛋白测定的影响就越大。结论：ε-PL能有效抑制尿液常见细菌的生长，能用于尿液样本防腐，但不适用于24 h尿蛋白测定标本的防腐。

【关键词】 ε-聚赖氨酸； 最小抑菌浓度； 尿蛋白； 干扰

【Abstract】 Objective：To understand the in vitro bacteriostatic effect of ε-Poly-L-lysine（ε-PL） on four common bacteria in urine，including Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa，and to explore its influence on urinary protein determination.Method：The broth dilution method was used to dilute the ratio of ε-PL and add the same amount of bacterial suspension.The MIC of ε-PL to Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa was observed after 24 hours in the incubator at 35℃.At the same time，different concentrations of ε-PL were added into the urine to analyze the interference of urine protein determination.Result：Solution ε-PL has obvious bacteriostatic effect on common bacteria in urine，such as Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Enterococcus faecalis and Pseudomonas aeruginosa，MIC were 0.02，0.01，0.04 and 0.01 mg/mL respectively，among them，ε-PL had the best bacteriostatic effect on Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.The urine protein in original urine and urine added with distilled water was compared，the differences was not statistically significant（P>0.05）.The urine protein in urine samples containing different concentrations of ε-PL were significantly higher than those of original urine，the differences were statistically significant（P<0.05），and the higher the concentration of ε-PL in urine，the greater the effect on the determination of protein.Conclusion：ε-PL can effectively inhibit the growth of common bacteria in urine，and can be used for the preservation of urine samples，but not for the preservation of 24 hours urine protein test specimens.

【Key words】 ε-Poly-L-lysine； MIC； Urine protein； Interference

First-authors address：Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine Zhuhai Hospital，Zhuhai 519015，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.33.038

ε-聚赖氨酸（ε-Poly-L-lysine，ε-PL）是1977年由日本科学家在放线菌培养过滤液中发现的一种新型天然防腐剂，是由25～30个赖氨酸残基的同型单体聚合物组成，赖氨酸通过α-羧基和ε-氨基形成的酰胺键连接在一起而成[1]。ε-PL是由微生物分泌的、具广谱抗微生物活性的多肽性类物质，易被生物降解，对人体无害，目前广泛应用于食品防腐中[2]。尿液樣本在常温下长时间存放会有细菌生长从而影响尿液某些成分发生改变而影响检验结果，为了保证检测结果的准确性，通常采用加入防腐剂的方法来抑制细菌生长。目前尿24 h蛋白测定常采用甲苯作为防腐剂，但甲苯对人体有致癌作用，探索新的尿24 h蛋白标本防腐剂具有重要意义。为此，本研究通过ε-PL对尿液中常见菌的抑菌效果，并探索其对尿蛋白测定的影响，验证ε-PL作为尿液防腐剂的可能性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC218531及粪肠球菌ATCCA29212均由法国梅里埃公司提供。

1.2 仪器与试剂 9 mm血培养基由广州迪景公司提供；比浊仪由法国梅里埃公司提供；隔水式电热恒温培养箱由上海跃进医疗器械有限公司提供；ε-PL购于郑州拜纳佛生物工程股份有限公司；VITROS350干式生化分析仪及尿蛋白试剂由美国强生公司提供。

1.3 方法

1.3.1 ε-PL培養液的配制 称取适量ε-PL，溶解于无菌生理盐水中，配制成ε-PL防腐剂原液25.6 mg/mL备用。取无菌试管12支（按顺序标记），除第1管外，每管加入尿液1 mL；先吸取防腐剂原液2 mL加入第1管中，再从第1管中吸取1 mL防腐剂原液加入第2管中，混匀后吸出1 mL加入第三管中，依次类推至第12管后，吸出1 mL弃去。这样各管中防腐剂的浓度依次为：25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125 mg/mL。每12管为一组并做好标记，一共设置4组分别对应4种受试菌株。另每组设“尿液对照”和“测试菌生长对照”各一管。

1.3.2 接种细菌及细菌培养 分别挑取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌制备0.5麦氏单位的受试菌液，取150 μL菌液加入15 mL新鲜无菌尿液中，混匀，取1 mL依次加入12支试管中，混匀，则得到ε-PL最终浓度依次为1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25、0.000 625 mg/mL的培养基。对照管不加菌液，测试菌生长对照管不加防腐剂。将上述处理的不同浓度ε-PL培养基放置室温中24 h后转种至血平板，35 ℃培养箱培养16～20 h后观察结果。

1.3.3 含不同ε-PL浓度的尿液配制及蛋白浓度测定 收集正常尿液混匀备用（干化学试纸阴性），将混合尿液分成7组，每组样本量为10 mL：第1组原尿10 mL，第2组9 mL原尿+1 mL蒸馏水，其余5组9 mL原尿分别加入1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL的ε-PL溶液1 mL，使其最终尿液ε-PL混合液中ε-PL浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL。采用邻苯二酚紫染料结合比色法，使用VITROS350强生干式生化分析仪对各溶液中的蛋白浓度进行检测，每组测定三次取平均值。

1.4 统计学处理 使用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ε-PL对尿液常见菌的抑菌情况 用倍比肉汤稀释法测得ε-PL对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌均有抑菌效果，最小抑菌浓度（MIC）分别为0.02、0.01、0.04及0.01 mg/mL，其中ε-PL对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果最好。见表1。

2.2 不同浓度的ε-PL溶液对尿蛋白测定的影响 采用VITROS350干式生化分析仪对混有不同浓度ε-PL的尿液标本进行尿蛋白测定，原尿液蛋白含量为（96.36±1.26）mg/L，加蒸馏水尿液中尿蛋白含量为（95.60±1.22）mg/L，与原尿液尿蛋白含量比较差异无统计学意义（t=0.615，P=0.310）；而含0.01、0.02、0.04、0.08及0.16 mg/mL不同ε-PL浓度尿液标本中尿蛋白含量分别为（122.30±2.20）、（146.90±1.30）、（177.93±0.15）、（341.30±2.40）及（695.70±7.47）mg/L，均明显高于原尿液，比较差异均有统计学意义（t=3.063、4.190、5.522、6.924、9.217，P=0.041、0.036、0.023、0.015、0.006），且随着尿液中ε-PL浓度的增加对蛋白测定的影响就越大。

3 讨论

肾脏作为人体调节物质代谢的重要枢纽，机体每天生理排泄一定尿液及尿液中各类物质尿液成分变化能反映肾小球和肾小管功能，检测尿液量和尿蛋白含量对肾功能，诊断治疗和预后判断都有一定的临床意义[3-4]。24 h尿蛋白定量也称为24 h尿蛋白排泄率，是通过收集24 h的全部尿液，来测定其中的蛋白质的含量，进而计算出24 h内的蛋白总量，因此可以准确地反映患者一天之中蛋白质丢失的情况。正常人的肾小球滤液中存在小分子量的蛋白质，在通过近曲小管时绝大部分又被重吸收，因此终尿中的蛋白质含量<150 mg/24 h。当尿中蛋白质超过正常范围时，称为蛋白尿，是肾脏疾病常见的临床表现，一些全身性疾病亦可出现蛋白尿[5-6]。尿液样本在常温下长时间存放会有细菌生长从而影响到尿液某些检测项目的结果，通常采用加入防腐剂的方法来抑制细菌生长。目前常用尿液24 h蛋白测定常用防腐剂为甲苯，虽然能起到尿液防腐作用，但长期使用会对患者或检验人员产生一定伤害[7-8]。因此，寻找安全可替代尿液防腐剂是目前研究的热点问题。

ε-PL是一种由赖氨酸单体通过ε-氨基和α-羧基形成酰胺键聚合而成的均聚物[9-10]，具独特功能的多肽结构，也是一种生物碱，具有广谱抗菌活性[11]、抗噬菌体活性、安全性高、水溶性和热稳定性好等特点，且易被生物降解，对人体无毒害，通常用作食品防腐剂[12-14]。ε-PL抑菌机制主要是将细菌细胞壁逐步破坏，从而使得碱性磷酸酶渗出，破坏细菌细胞膜的完整性，使其在细胞膜上形成穿孔并丧失其生理功能，先导致小分子物质渗出，使得胞外离子含量升高，当细胞膜发生崩解时大分子物质溢出，影响细胞内外蛋白质的合成，最终导致细胞死亡，起到抑菌作用[15-16]。本研究结果显示，当尿液中ε-PL浓度达到0.04 mg/mL及以上时对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌及铜绿假单胞菌等四种尿液中常见细菌均有抑菌作用，即0.04 mg/mL为尿液中最佳抑菌浓度，为尿液防腐的用量提供一定参考理论依据，与李宇雄等[17]报道相一致，这正说明了ε-PL溶液可用于尿液的防腐，且效果明显、安全。

目前临床实验室24 h尿蛋白定量检测主要采用染料结合法，其具有灵敏度高、重复性好、操作简便、快速、可自动化的特点[5-6]。本研究采用邻苯二酚紫染料结合比色法来检测ε-PL溶液对24 h尿蛋白测定结果的影响，结果显示，原尿液、加蒸馏水尿液中尿蛋白含量比较差异无统计学意义（P>0.05）；而含0.01、0.02、0.04、0.08及0.16 mg/mL不同ε-PL浓度尿液标本中尿蛋白含量均明显高于原尿液，比较差异均有统计学意义（P<0.05），且随着尿液中ε-PL浓度的增加对蛋白测定的影响就越大。提示当尿液中ε-PL溶液浓度达到0.01 mg/mL时就对尿蛋白测量结果产生明显干扰，且干扰程度随着尿液中ε-PL溶液浓度的增加而增加，这除了可能与ε-PL结构中存在大量的赖氨酸残基可与染料结合从而干扰测定有关[18]，也可能与ε-PL富含阳离子，易与带有阴离子的物质有强的静电作用力结合有关[19-20]。

综以上述，ε-PL浓度达到0.04 mg/mL及以上对尿液中常见细菌均有明显抑菌作用，但当ε-PL浓度达到0.01 mg/mL时对尿蛋白测定就产生明显干扰现象。因此ε-PL溶液可用于尿液的防腐，但不能用于尿蛋白测定的尿液防腐。

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（收稿日期：2018-09-11） （本文编辑：董悦）