子宫内膜癌分子分型与PD-1/PD-L1阻断治疗*

高境泽 吴 霞

(上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科，上海 200127)

子宫内膜癌(Endometrial cancer，EC)是常见的女性生殖道恶性肿瘤，无论是我国还是欧美国家EC的发病率逐年增高[1,2]。EC的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗和内分泌治疗。对于病灶局限于子宫的早期EC患者，手术即可达到较好的治疗效果；但当患者已存在转移病灶或疾病复发时，传统治疗方法疗效有限，患者预后通常较差[2]。对于转移或复发的EC患者，探询新的治疗方法如免疫治疗或靶向治疗已属当务之急。近年来随着分子生物学技术的进展，对EC的认识从传统病理分型进一步深入到分子分型，其中分子分型为POLE (DNA polymerase ε，POLE)突变型和微卫星不稳定(Microsatellite instability，MSI)高突变型EC患者可能是程序性死亡蛋白1(Programmed death protein-1，PD-1)/程序性死亡蛋白配体1 (Programmed death protein-ligand1，PD-L1)阻断治疗的获益人群，利用分子分型指导患者个体化免疫治疗有望成为EC治疗的重要临床策略。本文就EC传统病理分型、分子分型及PD-1/PD-L1阻断治疗在EC中的研究进展作一综述。

1 EC传统病理分型

1.1EC传统病理分型 基于EC发展过程中的雌孕激素作用、预后因素以及流行病学因素，1983年Bockman[3]提出了EC的传统病理分型方法，即将EC分为Ⅰ型(雌激素依赖型)和Ⅱ型(非雌激素依赖型)。Ⅰ型EC为子宫内膜样腺癌(Endometrioid endometrial cancers，EEC)，约占所有EC患者的80%。绝大多数EEC是低级别肿瘤(组织病理学分级为1级或2级)，其形成机制为“二步机制”，即由不典型子宫内膜增生或子宫内膜样上皮内瘤变发展为雌激素引发的“腺瘤癌”。EEC患者常伴有肥胖、高血压、糖尿病、肿瘤细胞雌孕激素受体阳性率高，预后良好。EEC中常见的基因突变有PTEN失活和K-Ras、β-catenin突变。Ⅱ型EC为非雌激素依赖性，主要包括浆液性癌(Serous carcinoma,SC)、透明细胞癌(Clear cell carcinoma,CCC)和癌肉瘤等，Ⅱ型EC侵袭性强，患者预后不良。Ⅱ型EC中常见的基因突变有Tp53、PIK3CA和PPP2RIA等[3]。

1.2EC传统病理分型的局限 如前所述，EC的传统病理分型可以部分反映肿瘤的特征，在临床工作中区分Ⅰ型和Ⅱ型EC对于选择治疗方案亦具重要指导意义。然而，传统病理分型的局限性也日趋明显。首先从形态组织学角度，由于一些EC肿瘤本身的变异性和病理学家专业知识不同，这些肿瘤的诊断可能含混不清，很难被精确归类于Ⅰ型或Ⅱ型[4]；其次从分子水平而言，尽管一些突变可能更常出现于Ⅰ型或Ⅱ型EC，但Ⅰ型和Ⅱ型EC的基因突变存在重叠，并且没有任何一个基因突变被发现仅特异性存在于Ⅰ型或Ⅱ型EC[5,6]；最后，EC的突变谱非常复杂，每一型EC本身就存在基因异质性。因此，为了更精准地为EC患者评估预后和制定个体化治疗方案，借助全基因组测序和转录分析技术探索EC的分子分型特征具有重要意义。

2 EC分子分型

近年来，随着基因测序技术的不断发展基于基因特征的肿瘤分类应运而生。1999年美国国立癌症研究所(NCI)提出了肿瘤分子分型的概念，即以高通量深度测序技术为基础，按照分子特征对肿瘤进行分类。2013年，美国癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA )对373例EC样本(包括307例EEC，53例SC，13例混合性)进行了基因组学、转录组学和蛋白组学的研究，提出将EC区分为POLE突变型(7%)，MSI高突变型(28%)，拷贝数低型(39%)和拷贝数高型/浆液性(26%)这四种分子亚型[7]。由于高通量深度测序经济成本高、耗时长，为降低EC分子分型的成本，Talhouk等使用p53免疫组化分析替代高拷贝数状态测定，结合POLE突变状态和错配修复(Mismatch repair，MMR)蛋白的免疫组化测试(MLH1，MSH2，MSH6和PMS2)对石蜡包埋标本进行联合分析，将全系列143例EC标本分成MSI-high型(41例，29%)，POLE突变型(12例，8%)，p53野生型(63例，44%)和p53突变型(25例，17.5%)[8]。作者提出，这种简单易行的方法可以在临床大规模使用以指导EC分子分型、危险分级和治疗。

2.1POLE突变型EC DNA聚合酶ε (DNA polymerase epsilon，polε)是在真核生物中发现的DNA聚合酶,与polα、polδ同属DNA聚合酶家族，并由POLE1、POLE2、POLE3和POLE4四个亚基组成[9]。POLE作为DNA聚合酶ε的核心催化亚基，具有DNA链延长和延长中校正复制错误这两种催化活性。聚合酶的校正过程，主要通过POLE的3′→5′核酸外切酶区域，对复制错误单链DNA进行识别和剪切[10]。正常情况下，平均一个碱基对在完成一次分裂时发生突变率约为10-10。如果POLE的核酸外切酶区域发生突变则会导致其无法完成校正工作，DNA复制过程中发生的碱基突变率将升高10～100倍,并导致大量突变的基因在细胞中累积。

POLE突变型的肿瘤包括EC、结直肠癌、高级别胶质瘤和卵巢癌，其中EC是迄今已知POLE基因出现突变比例最高的恶性肿瘤[10]。约5%～10%的EC在POLE的核酸外切酶区域中携带体细胞突变，即为POLE突变型EC。POLE突变型EC大多是EEC，特别是组织病理分级为3级的EEC (EEC3)，其特征性的突变谱包括PTEN (94%)、 PIK3CA (71%)、 PIK3R1 (65%)、FBXW7 (82%)、ARID1A (76%)、KRAS (53%)和ARID5B (47%)。较之其他类型EC，POLE突变型EC具有极高的突变负荷 (232×106mutations/Mb)[7]。

与其他三种分子分型的EC患者相比，POLE突变型患者可能会有更好的预后[11-13]。POLE突变型EC患者预后较好的确切机制尚不完全清楚，可能的原因有以下两点：①POLE突变型EC可能对标准的抗癌治疗如化疗或放疗更敏感[14,15]；②由于POLE突变型EC具有非常高的突变负荷，巨大数量的体细胞突变产生大量的肿瘤新生抗原，故POLE突变型EC可能为强免疫原性肿瘤，利于诱发机体的抗肿瘤免疫应答[16-18]。

2.2MSI高突变型EC 微卫星又称“短串联重复序列”，是遍布人类基因的编码和非编码区域基因中一段核苷酸重复序列，重复的单位长度为1～6个碱基[19]。随着DNA复制的进行，DNAMMR系统可识别和修复在DNA复制和重组过程中可能出现碱基的错误插入、缺失和部分类型的DNA损伤，故MMR对于监督DNA高保真复制具有重要意义[20]。当MMR系统缺陷时，即出现MSI。MSI现象存在于多种类型的实体瘤中如EC、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、肝胆管癌、尿路癌、脑癌和皮肤癌[21]。在肿瘤样本中，MSI表型可以通过PCR检测确定。1997年美国国立癌症研究所推荐将NR21、2NR24、NR27、BAT25和BAT26这5个微卫星位点作为MSI诊断的标准，通过对这5个位点进行PCR检测，可以将肿瘤分为3型：如果有2个或2个以上微卫星位点出现不稳定，称为微卫星高度不稳定型(MSI-high，MSI-H)；如果1个微卫星位点出现不稳定，称为微卫星低度不稳定型(MSI-low，MSI-L)；如果5个位点均未检测到不稳定，则称为微卫星稳定型(MSI-stable,MSS)[22]。

在所有EC病例中，MSI高突变型EC占比大约30%，其通常为EEC，且肿瘤细胞的组织病理学分级通常为高级别。MSI-H型EC具有较高的突变负荷 (18×106mutations/Mb)，其特征性的突变谱包括PTEN (88%)、RPL22 (33%)、KRAS (35%)、PIK3CA (54%)、PIK3R1 (40%)和RID 1A (37%)[23]。McMeekin等通过统计1 024例EEC的临床数据，发现MMR缺陷型EEC与一些不良预后因素如FIGO分期晚、肿瘤细胞高级别和淋巴脉管间隙受累及相关，但其预后与MMR完善型EEC无显著差异，这提示MMR缺陷抵消了这些不良预后因素的影响，即MMR缺陷EEC可能诱发了较强的抗肿瘤免疫应答[24]。

2.3低拷贝数型与高拷贝数型EC 拷贝数变异(Copy-number variant，CNV)被定义为基因组部分重复的现象[7]。具体来说，它是一定数量碱基对的一种复制或删除事件。在哺乳动物中，拷贝数变异在产生群体变异以及疾病表型方面起重要作用。基于TCGA的数据，低拷贝数型EC包括60.0%的低级别EEC，8.7%的EEC3，2.3%的SC和25%的混合型癌。低拷贝数型EC的突变负荷低(2.9×106mutations/Mb),常见的突变为 PTEN (77%)、CTNNB1 (52%)、PIK3CA (53%)、PIK3R1 (33%)和ARID1A (42%)。高拷贝数型EC涵盖5.0%的低级别EEC，19.6%的EEC3，97.7%的SC和75%的混合型癌，其预后是四种分型中最差的。高拷贝数型EC的突变负荷低(2.3×106mutations/Mb)，常见的突变为TP53 (92%)、PPP2R1A (22%) 和 PIK3CA (47%)。

3 EC分子分型与PD-1/PD-L1阻断治疗

3.1PD-1/PD-L1阻断治疗 近年来肿瘤免疫治疗突飞猛进。2012年《新英格兰医学杂志》报道了抗PD-1、PD-L1抗体在晚期肿瘤患者中获得了持久的肿瘤消退及疾病稳定期，这两个里程碑式的临床试验使肿瘤免疫治疗进入了一个新时代[25,26]。美国《科学》杂志将癌症免疫治疗列为2013年最重大的科学突破之一，这预示着免疫治疗在恶性肿瘤治疗领域的广阔前景。迄今多个临床试验已经证实了抗PD-1/PD-L1药物在晚期黑素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾细胞癌及霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤中的客观临床作用[27,28]。2017年6月，ASCO会议报道了PD-1单抗pembrolizumab联合E7080(乐伐替尼，多靶点抗血管生成药物)治疗EC的临床数据(注册号NCT02501096)。该试验中已纳入23例晚期EC患者(至少接受过一次系统治疗)，接受治疗后有11人(47.8%)达到部分缓解，另有11人(47.8%)为疾病稳定，研究结果显示了抗PD-1/PD-L1药物在EC治疗中的巨大潜力[29]。

3.2PD-1/PD-L1阻断治疗的疗效预测指标-TMB PD-1/PD-L1阻断治疗在大多数肿瘤中的有效率为40%左右，因此精准筛选能从该治疗中获益的患者、剔除不能获益的患者以避免治疗相关不良反应成为肿瘤学家的共识。肿瘤突变负荷(Tumor mutation burden，TMB)被认为可能是筛选PD-1/PD-L1阻断治疗获益患者的生物标志物之一。TMB代表在肿瘤样本中基因外显子编码区每兆碱基发生突变的数目，是评估肿瘤免疫原性的重要指标之一。理论上，这些突变的基因进行转录表达新的抗原，每兆碱基中累积的突变数目越多，其显示的抗原性就越强，肿瘤微环境中，免疫T细胞可识别杀伤的肿瘤细胞就越多。对一项使用nivolumab治疗非小细胞肺癌的Ⅲ期临床试验结果进行回顾性分析，依据TMB将患者分为三组，0～99个突变为低TMB组，100～242个突变为中TMB组，243个或以上突变为高TMB组。高TMB组nivolumab治疗效果明显优于化疗效果，患者对nivolumab和化疗药物的反应率分别为 47% 和 28%，疾病无进展生存时间分别为9.7个月和 5.8个月[30]。研究者认为：与肿瘤组织PD-L1表达水平相比，TMB作为生物标志物能更好地筛选出获益人群。Rizvi等人的研究同样显示在非小细胞肺癌患者中，pembrolizumab 临床疗效与TMB密切相关[31]。在高突变负荷(超过中位突变负荷)的非小细胞肺癌患者中，高达73%的患者可出现持久的临床获益(部分缓解或疾病稳定持续时间> 6个月)，而低突变负荷患者的持久临床获益率仅有13%，两组患者对pembrolizumab的客观反应率分别为63%和0，中位疾病无进展生存时间分别为14.5个月和3.7个月。

3.3POLE型EC与PD-1/PD-L1阻断治疗 如前所述，在EC的四种分子分型中，POLE型、MSI高突变型EC的肿瘤突变负荷较高，分别为232×106/Mb和18×106/Mb，远超其他组(2.6×106～2.9×106/Mb)，因此POLE型和MSI高突变型EC患者最有望从PD-1/PD-L1阻断治疗中受益[7]。Bellone等[32]检测了131例EC患者肿瘤组织的POLE突变情况，11例 (8.5%)患者为POLE突变型，与POLE野生型EC相比，POLE突变型EC肿瘤组织中浸润的CD4+、CD8+T淋巴细胞数量显著增加，且浸润T淋巴细胞表面PD-1表达显著升高，患者的疾病无进展生存时间亦显著延长。Mehnert等[33]对TCGA样本库中的EC标本进行了HE染色，POLE突变型EC肿瘤组织中淋巴细胞浸润最丰富，MSI突变型EC淋巴细胞浸润程度高于MSS型EC，但低于POLE突变型EC。上述研究结果提示POLE突变型EC肿瘤组织局部微环境中存在较活跃的免疫应答反应，如能在此基础上进一步给予PD-1/PD-L1阻断治疗则有望诱发更有效的抗肿瘤免疫反应。

虽然迄今尚无PD-1/PD-L1阻断治疗用于POLE突变型EC的大规模临床试验报道，但近期的几个案例报道都显示了PD-1单抗治疗POLE突变型EC疗效显著[34,35]。一名57岁的混合性透明细胞/内膜样EC患者经历手术、化疗及抗血管生成治疗后疾病依然进展。肿瘤组织全外显子测序发现该患者为POLE突变型EC，且具有极高突变负荷 (TMB=117.3/Mb，总突变数=4 660)。在开始接受nivolumab治疗的6周后，患者临床情况显著改善并恢复正常活动，在nivolumab治疗的第3、5及7个月所行CT扫描均显示腹部、盆腔内和腹膜后的转移灶显著消退[35]。另一例53岁EC(组织病理学3级)患者初次手术治疗后很快复发，患者接受化疗及外照射，2年后锁骨上淋巴结转移、后腹膜和盆腔淋巴结肿大致双下肢极度水肿，患者参加了一项pembrolizumab的Ⅰ期临床试验，用药后临床状况很快改善，双下肢水肿明显缓解。Pembrolizumab用药后的8周疗效评价为部分缓解，用药后14个月依然为缓解。对患者复发的肿瘤组织行基于杂交捕获的全基因组测序显示，POLE核酸外切酶区域存在突变，符合POLE突变型EC。

3.4MSI高突变型 EC与PD-1/PD-L1阻断治疗 2015年，Le等[36]的研究显示PD-1单抗pembrolizumab对于MMR缺陷肿瘤的疗效显著高于MMR完善的肿瘤。该研究表示，抗PD-1/PD-L1治疗MMR缺陷EC有效率较高的内在原因可能是MMR缺陷EC的强免疫原性。肿瘤组织的全外显子测序显示MMR缺陷肿瘤中平均有1 782个体细胞突变，其中预计有578个能产生新抗原；而MMR完善的肿瘤中仅有73个体细胞突变，预计能产生新抗原的仅21个[36]。2017年，Le等[37]进一步对86例(包括12种肿瘤类型)晚期MMR缺陷的肿瘤患者进行PD-1单抗pembrolizumab治疗，结果显示57%的患者出现客观影像学反应，21%的患者获得完全缓解。对治疗有应答的患者进行功能分析，发现与肿瘤突变抗原产生应答的新生抗原特异性T细胞克隆在体内快速扩增，提示存在大量突变抗原的MMR缺陷肿瘤对PD-1/PD-L1阻断治疗更敏感。在该项研究中包含了15例MMR缺陷的EC患者，这15例EC患者行pembrolizumab治疗的客观有效率为53%，疾病控制率则高达73%。

2017年5月，默沙东公司宣布美国FDA加速批准了PD-1抗体pembrolizumab对于MSI-H型或MMR缺陷性肿瘤的治疗。该批准适应证首次基于肿瘤分子分型特征而不是组织来源，这意味着分子分型在肿瘤精准治疗方面的重要地位，根据分子分型特征实行异病同治的时代已经开启。

4 展望

EC是常见的女性生殖道恶性肿瘤，目前对EC的认识从传统病理分型进一步深入到分子分型，其中分子分型为POLE突变型、MSI高突变型EC因携带大量突变基因故为强免疫原性肿瘤。对EC患者进行分子分型一方面有助于预后判断，更为重要的是利用分子分型指导患者个体化免疫治疗，以POLE突变和MSI-H为生物标记物有助于精准筛选能从抗PD-1/PD-L1阻断治疗中获益的EC患者、剔除不能获益的患者而免于治疗相关不良反应的伤害。此外，针对POLE突变型、MSI高突变型EC患者，将PD-1/PD-L1阻断治疗联合抗血管生成药物或传统放、化疗有望取得更好的临床疗效。期待尽早开展PD-1/PD-L1阻断治疗用于POLE突变型、MSI高突变型EC患者的多中心、大样本临床试验，使得免疫检查点阻断治疗能取得更多新进展，造福更多的EC患者。

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