幽门螺杆菌促进程序性死亡配体1在胃癌中的表达

曹龙磊 龚治林 于 杰 周启昌 叶 辉 郗昌磊

(长江大学第二临床医学院(荆州市中心医院)结直肠肛门外科，湖北 荆州 434020)

幽门螺杆菌(Hp)感染可引起胃炎、消化性溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等疾病，并且与胃癌发生有密切关系，Hp已被世界卫生组织定义为1类致癌因子。目前对Hp导致肿瘤的发生机制涉及多方面因素，具体机制仍然不明确。B7家族分子是一类在免疫反应中重要的免疫分子。其中B7-H1是B7家族中发现的第三个家族成员，又称其为程序性死亡配体(PD-L)1〔1〕，在免疫反应中发挥重要作用。研究证实B7-H1可以同T细胞表面的PD-1受体结合，从而抑制T细胞的增殖及促进其凋亡，抑制其功能，减少效应细胞因子的分泌〔2〕。B7-H1的表达是介导肿瘤细胞免疫逃避的重要机制之一，其在肿瘤细胞表面高度表达，从而抑制T细胞功能，逃避免疫监视，促进肿瘤的复发和转移〔3〕。目前，关于免疫环境和Hp感染的相互关系研究较少。本研究旨在探索Hp是否能够引起B7-H1分子在胃黏膜细胞中表达的变化及其机制。

1 材料与方法

1.1材料 胃黏膜活检标本取自华中科技大学同济医学院附属荆州医院(长江大学第二临床医学院)。胃黏膜标本包括表面及深层的胃黏膜组织。22例标本中Hp检测阳性和阴性各半。胃癌细胞系AGS购于上海中科院细胞库。RPMI1640培养基、胎牛血清均购于Gibco公司。引物购买于南京金斯瑞公司。TRizol试剂、qRT-PCR试剂盒、逆转录试剂盒均由TAKARA提供。SS1Hp菌株由华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科实验室赠送。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2胃癌细胞系的培养及共培体系 人胃癌细胞系AGS培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基当中。比浊法测定Hp数量，将Hp数/细胞数(1∶50)共培养于6孔板之中。

1.3RNA的提取 按TRizol试剂说明书步骤进行RNA的提取，用不含RNA酶无菌水对总RNA进行溶解，使用分光光度计在260 nm和280 nm下测定吸光度值，计算RNA浓度。

1.4PCR步骤 对细胞中PD-L1表达进行检测。使用GAPDH作为参照，正向引物： 5′-AAAGGTACCTAGAAGTTCAGCGCGGGATA-3′；反向引物： 5′-AAAGGATCCCAGCGAGCTAGCCAGAGATA-3。用上述步骤中1 μg总RNA同PD-L1正反引物各2 μl，5×Primer Script®缓冲液4 μl，Primer Script®RT酶混合物Ⅰ 1 μl，双蒸水补至20 μl体系。按下列条件反应：37℃15 min，95℃15 s。反应得到的cDNA放置于-80℃备用。之后进行实时定量PCR。体系20 μl，含有以下组分：SYBR®Primix Ex TagTMⅡ(2×)10 μl，PD-L1正义引物(5 μmol/L)1 μl，PD-L1反义引物(5 μmol/L)1 μl，cDNA 2 μl，双蒸水6 μl。反应条件：95℃预变性15 s；95℃变性10 s，60℃退火25 s，70℃延伸12 s，循环30次。使用Applied Biosystems7500系统，每样设3个复孔，以GAPDH为内参，相对定量，用N=2-ΔΔCt表示感染Hp胃组织中PD-L1相对正常组织表达的倍数，此时ΔΔCt=(CtPD-L1-CtGAPDH)感染Hp-(CtPD-L1-CtGAPDH)未感染Hp。

1.5T细胞凋亡实验 从人外周血中提取外周血单核细胞(PBMC)，再用CD4阴性选择试剂盒(Stemcell，Canada)提取CD4+T细胞，鉴定纯度大于95%。AGS细胞4×105接种与24孔板中，24 h之后，加入Hp培养，再过48 h，用mitomycinc 10 μg/ml处理细胞2 h。计数1.5×106个上述提取的T细胞，96孔板培养，加入CD3、CD28抗体(浓度均为1.25 μg/ml)细胞。培养12 h后加入24孔板中共培养24 h后提取非贴壁细胞检测碘化丙啶(PI)，AnnexinV/PI染色测定凋亡。

1.6ELISA测定共培养体系中细胞因子分泌 包被：将肿瘤坏死因子(TNF)-α及干扰素(IFN)-γ抗体包被缓冲液进行稀释。在反应孔每孔中加入0.2 ml，4℃过夜。然后弃去孔中所有液体，洗涤缓冲液充分洗涤3次，5 min/次。加样：抽取培养基上清100 μl移入反应孔之中，37℃下孵育60 min。洗涤缓冲液洗板，5 min/次，洗涤3次。在每个反应孔中放入酶标记抗体150 μl，37℃下反应40 min。洗板3次，5 min/次。上述孔中加入四甲基联苯胺(TMB)液150 μl，37℃反应20 min，然后放入终止液50 μl。使用酶标仪上读数，根据标准品浓度，计算样品浓度。

1.7统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1PD-L1在Hp感染的胃黏膜组织及细胞系中的表达 Hp阳性组PD-L1(2.149±0.213)较Hp阴性组(1.004±0.213)明显上升(P<0.05)。细胞系体外实验发现,AGS同Hp共培养时PD-L1(2.834±0.173)较无Hp培养的AGS组(1.091±0.123)显著增加(P<0.05)。说明PD-L1上调同Hp感染有显著关联。

2.2Hp上调CD4+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的表达 Hp同CD4+T细胞一起培养，IFN-γ为(88.654±9.683)ng/ml，TNF-α为(28.144±3.183)ng/ml。无Hp感染组IFN-γ为(23.771±4.633)ng/ml，TNF-α为(5.091±3.231)ng/ml，差异显著(P<0.05)。

2.3IFN-γ和TNF-α促进AGS细胞表达PD-L1 AGS细胞中加入IFN-γ和TNF-α后，PD-L1为(2.234±0.410)、(5.512±0.624)，相对于对照组〔(1.034±0.098)、(1.001±0.314)〕显著上升(P<0.05)。

2.4Hp刺激后AGS细胞促进CD4+T细胞的凋亡 采用AGS同CD4+T细胞进行共培养，对比Hp未刺激组T细胞凋亡率为(3.5±1.6)%，Hp刺激后T细胞的凋亡率为(13.7±1.9)%，加抗PD-L1抗体后T细胞凋亡率为(4.9±1.3)%，加IgG后T细胞凋亡率为(15.3±1.8)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。Hp感染的AGS细胞可促进CD4+T淋巴细胞凋亡，此种效应可被抗PD-L1抗体(10 μg/ml)阻断，而同型IgG抗体无此效果。

3 讨 论

目前对胃癌的治疗仍然是以手术和药物治疗为主。对于进展期或晚期的胃癌，疗效仍然相当有限。Hp是已知的能在胃黏膜长期存活的唯一细菌〔4〕。Hp感染常常导致胃十二指肠消化性溃疡的发生。研究表明，胃癌发生及发展与Hp感染有着一定的联系〔5～8〕。研究表明，Hp可以通过分泌毒素(如CagA等),引起胃黏膜细胞一系列的生理病理变化，也可以改变胃黏膜局部炎症微环境，影响细胞状态，改变胃黏膜细胞增殖、凋亡等一系列变化〔7，9～11〕。

近些年来，免疫逃避被认为是肿瘤难以治愈和复发的重要因素〔2，12，13〕。肿瘤细胞在其细胞表面能表达一些小分子，使其能够躲避机体免疫系统，并且下调相应免疫细胞功能，使得肿瘤细胞逃避免疫细胞的免疫杀伤作用而存活。有许多免疫抑制分子，PD-L1就是其中之一。PD-L1表达在多种免疫递呈细胞或者一些其他细胞表面，以此来调节淋巴细胞〔12，14，15〕。研究发现，一部分肿瘤细胞表面PD-L1表达上升。PD-L1在肿瘤中的表达程度与预后呈负相关〔16〕。PD-L1高表达往往促进肿瘤复发及转移。有些肿瘤PD-L1是判断预后指标之一。目前PD-1单抗已经上市，并在一些肿瘤治疗中取得效果〔1，17，18〕。

本次研究发现，无论是在胃黏膜标本中或者胃癌细胞系中，Hp的存在可以促进PD-L1的转录表达。这提示Hp的存在造成了胃环境炎症及损伤的同时，还产生了免疫抑制的效果。而免疫监视能力的减弱往往导致了肿瘤发生和难以控制。本研究发现Hp能够促进激活的CD4+T淋巴细胞产生TNF-α和IFN-γ，TNF-α和IFN-γ这两种细胞因子均可以促进PD-L1转录及表达。说明Hp不单可以直接作用于胃黏膜细胞，并且能够通过刺激CD4+T淋巴细胞分泌细胞因子，作用于胃癌细胞，使其表达PD-L1，介导免疫抑制效应。

本研究使用CD3和CD28抗体激活CD4+T淋巴细胞会表达PD-1受体并能发挥相应的免疫作用。将Hp培养后的AGS细胞同激活的淋巴细胞共培养后发现，Hp刺激后的细胞可以促进T淋巴细胞的凋亡，此种作用可以被抗B7-H1抗体阻断。这说明Hp可以刺激胃癌细胞表达PD-L1，并进一步抑制激活淋巴细胞的免疫效应，抑制免疫，由此导致局部的免疫监视能力减弱。从而导致异常变异的胃黏膜细胞的存活机会增加，由此可能增加了胃癌的发生概率。