水环境中磺胺嘧啶胁迫下异育银鲫的组织病理学研究

郑婷婷 涂宗财, 唐平平 张 露 沙小梅 王 辉

(1. 江西师范大学生命科学学院, 功能有机小分子教育部重点实验室, 南昌 330022;2. 南昌大学食品与科学技术国家重点实验室, 南昌 330047)

磺胺类药物是一类具有对氨基苯磺胺结构的药物的总称, 因其价值低廉同时具有广谱杀菌功能而被大量应用于人类和动物疾病的治疗[1]。1932年,磺胺类药物首次用于临床试验, 而近几年在中国的产量已经达到每年2—5×107kg[2]。研究表明, 在中国海河流域、辽河盆地及其邻近的辽东湾的地表水和废水中磺胺类药物频繁被检测出, 检测浓度为8.4 ng/L—211 μg/L[3,4]。有文献报道, 美国USGS调查了抗生素滥用较严重地区的污水、饮用水以及地表水中抗生素的含量, 其中磺胺类药物的检出率最高[5]。人类长期受磺胺类药物污染, 会出现排尿和造血紊乱等一系列健康问题[6]。另外, 由于磺胺类药物在人体中的代谢时间较长, 容易导致耐药性的产生, 并且具有潜在的致癌性, 对人类健康产生了严重的安全隐患[7,8]。

目前, 国内外有关磺胺类抗生素的研究多停留在药代动力学以及痕量检测方面, 其在生态毒理学方面的研究也越来越受到重视。有研究报道, 磺胺嘧啶的摄入对斑马鱼的孵化、心率及自主运动均具有不良影响[9,10]。谢美萍等[11]发现低浓度下的磺胺类药物会对斑马鱼的代谢功能产生影响。然而,对水环境中的磺胺类抗菌药物进入水生生物体后对其各组织的病理变化却少有研究。异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是我国淡水鱼养殖的主要种类之一, 因其生长快, 周期短, 营养价值高, 味道鲜美等优点被人们所喜爱, 产量较大。水环境中磺胺嘧啶对异育银鲫的组织病理学研究未见报道,因此, 本实验以磺胺类抗菌药物中比较具有代表性的磺胺嘧啶为实验药物, 将异育银鲫分别在含不同浓度磺胺嘧啶的水环境中饲养28d, 观察其肝脏、肾脏、鳃、肠、肌肉等组织的病理变化, 旨在探讨水环境中磺胺嘧啶作用下对异育银鲫的组织病理变化规律, 为异育银鲫的健康养殖和磺胺嘧啶的科学合理用药提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

仪器与试剂仪器: JJ-12J脱水机, 武汉俊杰电子有限公司; JB-P5 包埋机, 武汉俊杰电子有限公司; RM2016 病理切片机, 上海徕卡仪器有限公司;JB-L5 冻台, 武汉俊杰电子有限公司; KD-P组织摊片机, 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司; DHG-9140A烤箱, 上海慧泰仪器制造有限公司; 10212432C载玻片及盖玻片, 江苏世泰实验器材有限公司;Nikon Eclipse CI正置光学显微镜, 日本尼康; Nikon DS-U3 成像系统, 日本尼康;

试剂: 无水乙醇、二甲苯、盐酸、氨水、中性树胶购于国药集团化学试剂有限公司; 苏木素-伊红染液购于武汉谷歌生物科技; 甲醛购于天津市大茂化学试剂厂。

试验生物异育银鲫由南昌市某养殖场提供, 平均体重(25±2) g。采用实验室模拟半静态法对其进行驯养, 试验用水为经曝气去氯处理24h的自来水, 为保持试验药液的浓度不低于起始浓度的80%, 试验期间每隔24h更换药液1次, 水温保持在(20±1)℃, pH为 7.02—7.25左右。驯养期间, 每天正常喂食, 每次投放饲料的量不超过鱼体重的1%。鱼体在正式实验开始前对其进行为期1周的驯养。

1.2 方法

试验设计因实验中药品的影响质量浓度一般为μg/L至mg/L水平, 同时结合水体中磺胺类药物的检出浓度, 所以设置了高、中、低3个质量浓度梯度和1个空白对照: 0、1 μg/L、100 μg/L、10 mg/L。

样品处理鱼体的染毒方式采用静态水质接触染毒。于暴露后的第7、第14、第21、第28天,分别从对照组和实验组随机取出3条鱼, 解剖取出肾脏、肠、鳃、肝胰脏、肌肉固定于10%的中性福尔马林中24h后, 用石蜡包埋, 连续切片(4 μm)。将烘干的切片依次放入二甲苯、酒精中进行脱蜡处理, 取出切片用蒸馏水冲洗, 然后进入染色阶段。病理切片采用苏木精-伊红(HE)染色, 中性树胶封片后用显微镜观察并拍照。

2 结果

2.1 肝脏组织病理变化

不同浓度的磺胺类药物处理对异育银鲫肝脏组织的影响如图1所示。空白组的肝脏组织切片如图1L所示, 其结构完整、清晰, 包括完整的中央静脉、肝小叶、肝血窦等结构。肝细胞呈多角状, 体积虽有大小不同, 但形状均无差异, 围绕着中央静脉整齐紧密排列。细胞界限清楚, 细胞质染色较细胞核浅且均匀, 圆形细胞核大而规则, 基本位于细胞中央。肝上皮细胞、肝血窦内皮细胞、红细胞等各类细胞健康无损伤。磺胺嘧啶暴露7d后, 低浓度(1 μg/L)组和中浓度(100 μg/L)组肝脏组织除了出现中央静脉和肝血窦轻度充血外, 基本没有出现其他损伤和异常。高浓度(10 mg/L)组肝细胞肿胀、部分肝细胞出现空泡化, 少数细胞核偏离细胞中央靠近细胞一侧, 另外部分区域肝细胞索模糊。磺胺嘧啶暴露14d后, 肝脏组织损伤较暴露7d更为严重,低浓度和中浓度处理组肝细胞肿胀, 空泡化, 细胞间隙增大, 中央静脉、肝血窦和肝小叶间出现淤血。高浓度处理组的肝组织则大量炎性细胞浸润,肝细胞空泡化, 溶解, 崩溃, 造成部分局灶性坏死。磺胺嘧啶处理21d后, 各浓度组肝脏组织出现严重损伤, 表现为中央静脉和肝血窦淤血严重, 大量炎性细胞浸润, 严重的较大面积的肝细胞坏死。28d后, 各浓度处理组肝脏组织损伤较为相似, 除肝血窦和中央静脉淤血外, 细胞肿大严重, 细胞间隙扩大, 严重空泡化, 细胞核固缩甚至消失, 细胞坏死。

2.2 肾脏组织病理变化

不同浓度的磺胺类药物处理对异育银鲫肾脏组织的影响如图2所示。空白组肾脏组织(图2K)实质均匀, 结构完整, 具有清晰可见的肾小球和肾小管。肾小管由排列整齐且紧密的上皮细胞组成, 中间为管腔, 肾小球中央为一团毛细血管, 最外层为肾小囊, 两者之间为囊腔, 各类细胞基本无损伤。磺胺嘧啶处理7d后, 低、中、高浓度处理组均发生了较为相似的损伤, 肾小管上皮细胞肿大, 与正常组相比肾小管上皮细胞排列较为疏松, 肾小球和肾间质轻微出血。另外, 中、高浓度组肾脏组织肾小管腔隙变大。14d处理后, 低浓度组肾小管细胞排列稀疏, 上皮细胞空泡化严重, 肾小球淤血, 部分肾小球细胞坏死, 溶解, 肾间质血细胞出现淤血,细胞出现滴状玻璃样变性。中浓度和高浓度组, 肾小管上皮细胞肿大, 空泡化, 坏死, 肾小管腔变小,甚至消失。部分肾小球细胞坏死, 肾小球崩解, 结构破坏, 肾间质组织出现坏死区。21d处理后, 低浓度组肾脏组织充血明显。中浓度和高浓度组的肾间组织细胞空泡, 溶解, 坏死严重, 出现较大面积空白。高浓度组的肾小管上皮细胞空泡样变性严重,肾小球淤血, 肾间组织空泡, 坏死, 淤血严重。28d处理后, 低浓度组与之前损伤无显著差异。中浓度和高浓度组的肾脏组织损伤更为严重, 肾小管上皮细胞核固缩, 严重的肾小管组织失去原有结构,出现坏死, 肾间组织细胞空泡, 出现大片坏死。

图1 肝脏的组织病理Fig. 1 Histopathology of liver (×200)

图2 肾脏的组织病理×200Fig. 2 Histopathology of kidney×200

2.3 鳃组织病理变化

不同浓度的磺胺类药物处理对异育银鲫鳃丝结构的影响如图3所示。空白组的鳃丝表面平缓舒展, 鳃小片分布均匀、梳妆排列整齐, 结构完整, 长短均匀, 各类细胞基本无损伤、脱离(图3G)。不同浓度的磺胺嘧啶对鳃组织结构具有不同程度的损伤, 表现出一定的时间和剂量效应。磺胺嘧啶暴露7d后, 各浓度组均出现较为轻度的损伤, 具体表现为鳃小片上皮细胞出现肿胀、鳃小片基部上皮细胞不同程度增生。中浓度组鳃小片上皮细胞脱落,导致鳃小片变短。高浓度组鳃小片无规则扭曲。14d后, 低浓度组鳃小片间上皮细胞增生持续加重,部分充满鳃小片的间隙。中浓度组, 鳃小片间细胞增生严重, 使鳃丝成板状, 鳃小片变短, 但依然存在。高浓度组鳃组织损伤严重, 鳃小片结构消失,鳃丝部分细胞坏死。21d后, 低浓度组鳃小片充血严重。中浓度组鳃小片结构消失。28d后各浓度组鳃组织病理变化与21d的无明显差别 。

图3 鳃的组织病理×400Fig. 3 Histopathology of gills×400

2.4 肠道组织病理变化

不同浓度的磺胺类药物处理对异育银鲫肠道绒毛结构的影响如图4所示。空白组的异育银鲫的肠道绒毛完整, 排列整齐紧密, 各类细胞无明显损伤(图4G)。磺胺嘧啶处理7d后, 低浓度处理组的肌层血细胞增多, 黏膜下层增厚, 黏膜上皮细胞变性,细胞排列疏松, 微绒毛变短, 部分区域微绒毛结构破坏, 脱落。中浓度组的肠道组织比低浓度组损伤更为严重, 除黏膜下层增厚外, 出现较多坏死区域;固有层细胞肿大, 且出现较多空泡化细胞; 部分黏膜皱襞破损, 甚至裂开; 黏膜层层上皮细胞变性坏死, 甚至溶解, 溃烂, 导致微绒毛损坏, 肠腔内出现较多脱落的微绒毛。高浓度组损伤和中浓度组相类似, 均比较严重。处理14d后, 各浓度组肠道组织病变具有较大的缓解, 肠道结构较为完整, 只有少部分微绒毛脱落, 然而随着磺胺嘧啶暴露时间的累加, 肠道组织又出现较大的损伤。处理21d后, 中高浓度组的杯状细胞增多, 肠道上皮细胞空泡, 坏死导致部分微绒毛脱落, 黏膜皱襞相互融合, 连接。固有层细胞变性, 坏死, 导致固有膜结构消失。处理28d后, 低浓度组的肠道依旧损伤较小, 肌层部分区域出现空泡化坏死细胞和黏膜层杯状细胞增多,而中高浓度组损伤和21d相差不大, 表现为持续损伤。

2.5 肌肉组织病理变化

不同浓度的磺胺类药物处理对异育银鲫肌肉组织结构的影响如图5所示。空白组肌肉组织的肌纤维呈多角形, 含有多个细胞核, 排列紧致有序(图5M)。磺胺嘧啶处理7d后, 低浓度组有轻度损伤, 表现为肌纤维间隙变宽, 肌纤维轻微弯曲并有缝隙。中浓度组的肌肉组织损伤增大, 肌纤维轻微变性,肿大, 部分相邻肌纤维出现聚集, 呈团块状, 肌纤维疏松, 弯曲, 甚至断裂。高浓度组的肌纤维断裂, 甚至溶解, 坏死, 出现一些空白的孔洞, 横纹模糊。14d处理后, 低浓度组的肌纤维弯曲断裂, 表面孔洞较多。中浓度组和高浓度组损伤类似, 肌纤维弯曲、断裂严重。经高浓度21d和28d处理的异育银鲫的肌纤维溶解, 崩溃, 并出现碎片化。

图5 肌肉的组织病理×100Fig. 5 Histopathology in muscle ×100

3 讨论

磺胺嘧啶为广谱抗菌类药物, 目前国内外用于水产动物疾病防治的磺胺药物有十多种, 而磺胺嘧啶为其中比较具有代表性的一种, 用量较大, 易残留于水环境, 造成污染, 同时可能会引起水生生物组织结构的病变。本实验异育银鲫在磺胺嘧啶暴露后, 肝脏、肾脏、鳃、肠道、肌肉均发生了不同程度的损伤, 其中肝脏、鳃、肾脏损伤尤为严重,且磺胺嘧啶处理时间的延长, 剂量的增加会导致组织损伤加重。

肝脏是鱼类维持生命活动和代谢的实质性组织器官, 具有解毒和防御功能, 外来污染物质可在肝脏组织进行代谢和生物转化, 过量的毒性物质会对肝脏造成不同程度的损伤[12]。肝脏组织中含有大量的酶, 肝脏受到病理损伤时易改变酶的活性。磺胺类药物大多易在肝脏发生乙酰化, 造成过高浓度时可能会影响肝脏组织酶的活性, 进而引发组织病理变化。本实验表明, 磺胺嘧啶对异育银鲫肝脏组织具有损伤作用, 表现为肝组织淤血, 炎性细胞浸润, 空泡化, 严重的出现肝细胞核固缩, 溶解, 大面积坏死等。大量的研究也表明水环境中的一些污染毒性物质易引发鱼类肝脏组织造成本实验所出现的损伤。Zodrow等[13]研究发现, 斑马鱼在受到二噁英类化合物TCDD毒性作用后, 肝脏组织出现肝细胞肿大, 坏死, 细胞数量减少等现象。王荻等[14]研究表明诺氟沙星可造成肝细胞肿胀、核固缩甚至肝细胞消溶等损伤。张涛等[15]研究发现, 水中高浓度的氨氮、亚硝酸盐会引发黄颖鱼肝脏组织局灶性坏死。韩冰等[16]研究阿维菌素对松浦镜鲤的组织病理变化, 结果发现阿维菌素可造成肝脏组织肝血窦淤血, 细胞质变淡, 细胞核溶解消失。

肾脏是鱼体重要的排泄和免疫器官, 具有调节内环境使其保持稳定的功能。肾脏组织发生病变后, 易造成内环境酸碱、体液、内分泌等功能异常,进而损害鱼体健康生长[17]。磺胺类药物及其代谢产物难溶于水, 经肾脏排泄时易析出晶体, 造成肾小管堵塞, 引起肾脏发生病变[18]。异育银鲫在磺胺嘧啶环境中暴露后, 肾脏组织出现持续的病理损伤,表现为肾小管上皮细胞空泡化, 肾小球细胞坏死,肾间质淤血, 出现坏死区等。研究表明[19], 罗非鱼感染海豚链球菌病后肾小管上皮细胞发生水肿, 坏死, 与本文损伤较为一致。肾小管上皮细胞肿胀,坏死, 易肾组织的渗透作用削弱, 进而引起排泄异常, 严重导致肾功能衰竭。另外, 还有研究表明[20],肾脏组织遭受病理损伤后, 血浆中渗透压平衡打破,导致渗透压降低, 引起肾脏组织淤血, 与本实验结果相符合。

鳃是鱼类的呼吸器官, 具有气体交换, 调节体内渗透压、酸碱、离子平衡, 排泄一些含氮废弃物等多种重要功能。鱼鳃在呼吸过程中与外界水环境直接接触, 也极敏感, 易受水环境中化学、物理、生物等污染物影响, 造成组织病理损伤。水环境中污染物对鱼鳃的损伤作用主要包括两种, 一种是防御反应产生的损伤, 包括上皮细胞肿大, 鳃小片隆起等, 另一种是药物直接损伤, 如上皮细胞坏死脱落, 鳃结构破坏等[21,22]。在本实验中, 根据异育银鲫经磺胺嘧啶胁迫后产生的病理变化, 推测可能前期主要为防御反应损伤, 后期为直接损伤。大量研究表明, 水环境中的污染物对鱼鳃具有毒性作用, 极易造成病理损伤。Biagini等[23]研究表明水中污染物会对罗非鱼鳃组织造成鳃小片顶端膨大, 基部融合等与本文相似的病理变化。王晓光[24]研究了4种不同浓度的溴氰菊酯暴露对斑马鱼鳃组织的病理变化, 经溴氰菊酯暴露后鳃小片上皮细胞肿胀,增生, 顶端膨大, 严重者基部发生融合。而鳃小片上皮细胞增生严重会影响鱼正常呼吸和分泌等, 甚至引起鱼体缺氧, 严重影响鱼健康生长[25]。重金属污染也易使鱼鳃发生组织病变, 聂志娟等[26]发现暴露在3 mg/mL的Cu2+环境中刀鲚幼鱼的鳃损伤较为严重, 毛细血管充血, 鳃小片发生脱落。鳃组织损伤后易感染一些致病菌, 引发新的疾病, 因此养殖鱼类在使用抗生素类药物时, 应避免因用药造成鳃组织损伤。

肠道是鱼类消化吸收营养物质的场所, 肠道组织健康对鱼类生长至关重要。肠道组织发生病变后, 易造成鱼体营养不良, 生长滞缓, 对鱼类养殖危害巨大。异育银鲫在磺胺嘧啶的水体中暴露, 肠道组织产生相关病理变化, 表现为肠道微绒毛脱落,黏膜下层增厚, 黏膜皱襞出现破损等。肠道黏膜皱襞的高低疏密, 微绒毛的发达程度, 杯状细胞数量多少都对鱼体消化吸收能力具有影响作用[27]。因此, 磺胺嘧啶暴露后微绒毛脱落, 黏膜皱襞破损均会影响鱼体的消化吸收。然而, 磺胺嘧啶暴露14d后, 其肠道组织损伤反而减少, 这可能是因为鱼体自身在应对外界毒性物污染后, 会启动应激反应,产生一定的适应性。但是, 随着磺胺嘧啶暴露时间的持续加长, 依然会对肠道组织产生不同程度的损伤。Puerto等[28]研究报道水环境中微囊藻毒素会导致罗非鱼肠道组织发生上皮细胞脱落, 绒毛和微绒毛结构破坏等病理变化。

鱼肌肉是人类动物蛋白质的重要来源, 肌肉组织发生病变损伤会使肌肉品质下降。另外, 肌肉组织主要负责鱼体各种的运动功能, 肌肉组织病变异常的会引起鱼的运动能力下降。在本实验中, 随着异育银鲫在磺胺嘧啶水体中暴露时间的延长, 浓度的增大, 肌肉组织损伤不断加重, 表现为肌纤维排列疏松, 紊乱, 甚至断裂等。陈涛等[29]研究氰戊菊酯对鲇鱼肌肉组织的病理损伤影响, 发现氰戊菊酯会导致鲇鱼肌肉组织表面疏松, 肌纤维不规则, 肌纤维间隙变大等, 这与本实验结论相一致。陈秀荣的研究[30]也发现氰戊菊酯会引发草鱼肌纤维排列紊乱, 疏松, 不规则等病变。

综上, 水环境中磺胺嘧啶会对异育银鲫产生不同程度的组织病理损伤, 其中肝脏、鳃、肾脏组织损伤程度大, 而且随着磺胺嘧啶暴露时间的延长、浓度的加大, 各组织的病理损伤更为严重。

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