赤水河半鳆的遗传多样性和种群历史动态分析

李文静 王环珊 刘焕章 曹文宣 王小明 于 江 朱 昕

(1. 中国科学院水生生物研究所水生生物多样性与保护重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049;3. 中国三峡建设管理有限公司, 成都 610041)

赤水河有着美酒河、生态河、英雄河的美称,是长江上游唯一一条干流未建水坝, 且与长江保持连通的大型一级支流[1]。赤水河作为长江上游珍稀、特有鱼类国家级自然保护区的重要组成部分,是一个与保护区既相联系又相对独立的系统。根据中国科学院水生生物研究所的监测, 半鰐在赤水河有一定的种群数量, 因此具有着重要的保护价值。

半鰐Hemiculterella sauvagei隶属于鲤形目Cypriniformes鲤科Cyprinidae鲌亚科Cultrinae半鰐属Hemiculterella, 地方名称蓝片子、鰐条、蓝刀皮[1,2]。半鰐是长江上游特有鱼类, 在长江上游干流、沱江、岷江、嘉陵江、青衣江和大渡河等水系有分布[2,3]。近年来, 由于水利工程建设、酷渔滥捕等人为条件的影响, 其野生资源已受到严重威胁。目前, 关于半鰐的研究主要涉及其地理分布[4]、年龄和生长[1]、繁殖生物学[5]、寄生虫[6]、物种保护[7]以及线粒体全基因组序列的测定[8], 但有关半鰐的遗传多样性及种群历史动态的工作尚未得到充分开展。遗传多样性不仅是生物多样性的核心部分, 也是生命进化和物种分化的基础, 更是评价自然生物资源的重要依据[9]。

线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)具有相对较高的进化速率, 目前已广泛应用于各种动物类群的系统发育和种群遗传多样性研究[10]。Cytb基因是一段编码蛋白质的DNA序列, 已有的研究表明在鲤形目鱼类的物种及种以下阶元中, 其进化速率明显高于控制区基因[11], 因而在鲤形目鱼类种群的遗传多样性和历史动态研究中比控制区更加合适[12—16]。

本研究选取赤水河水潦、茅台、赤水市、二合及太平5个不同地理种群的168尾半鰐为实验对象, 对其Cytb基因序列进行扩增并测序, 期望通过研究半鰐种群的遗传多样性, 对赤水河半鰐资源现状进行评估, 从而为半鰐资源的保护提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

半鰐样本采自赤水河5个地点(水潦、茅台镇、赤水市、二合镇、太平镇), 采样地点、样本数量见图1和表 1。从每尾新鲜样本背鳍以下、侧线以上的右侧取2—3 g肌肉, 以95% 的酒精固定于离心管中带回实验室, 样本储存于4℃的冰箱中。另外,在GenBank中下载鰐(Hemiculter leucisculus)(登录号为AY089716)和蒙古鲌(Culter mongolicus)(登录号为AP009060)的Cytb序列作为外类群。

1.2 基因组DNA的提取以及PCR扩增

本研究采用改进的高盐法提取基因组DNA[17],并采用以下引物来扩增Cytb基因序列: L14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′和H15915(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[18]。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的反应总体积为30 μL: 10×buffer 3.0 μL,dNTP (2.5 mmol/L)1.5 μL,Taq聚合酶0.25 μL, 模板DNA 3 μL, 正反向引物各1 μL, ddH2O 20.25 μL。PCR反应程序为: 94℃变性4min, 接着是35个循环,每个循环包括: 94℃变性45s, 56℃退火45s, 72℃延伸1min, 然后72℃延伸10min, 最后10℃保存10min。

用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增的产物进行检测, 挑选其中有目的条带, 且条带清晰的产物送生物公司进行纯化及测序。

1.3 数据处理及分析

使用Clustal X[19]和Seaview[20]对测序结果进行序列编辑、校对和排序。

图1 赤水河流域半鰐采样点(●代表采样点的位置)Fig. 1 Sampling sites of Hemiculterella sauvagei in Chishui River (●indicates sampling site)

表 1 基于线粒体Cyt b基因的赤水河半鳆各地理种群遗传多样性Tab. 1 Genetic diversity in five populations of Hemiculterella sauvagei in the Chishui River based on mtDNA Cyt b gene

使用DnaSP 5.0软件[21]计算单倍型数目(Num-ber of haplotypes)、多态位点数目(Number of polymorphic sites)、单倍型多样性(Haplotype diversity)、核苷酸多样性(Nucleotide diversity)、变异位点(Variable sites)、单一突变位点(Singleton sites)、简约信息位点(Parsimony-informative sites)等。

使用Mega 6.0软件[22,23]计算序列的碱基组成、种群间的净遗传距离, 采用邻接法(Neighborjoining, NJ)[24]以鰐和蒙古鲌为外类群, 构建单倍型系统发育树。使用Network软件, 以中接法(Medianjoining)构建单倍型的网络关系图, 检测各个单倍型间的进化关系。

使用Arlequin 3.11软件[25]统计遗传分化水平,采用分子变异分析(Analysis of Molecular Variance,AMOVA)检测遗传变异来源, 估算种群遗传结构和地理种群遗传变异的分布。用种群差异的精确性检验(Exact tests of population differentiation)[26]来估计2个种群的分化水平指数Fst, 并采用Tajima’s D和Fu’s Fs中性检验以及核苷酸不配对分布(Mismatch distribution)来检测种群历史动态。通过粗糙指数(Harpending’s Raggedness index, Hri)[27]来检测核苷酸不配对分布与种群扩张模型下期望分布之间的拟合优度。对于不能拒绝种群扩张模型而且错配分布呈现光滑单峰的种群, 用公式τ=2ut估算种群扩张时间[28], τ为Tau, 是种群扩张参数, t为每个世代种群的扩张时间, u为每个世代每条序列的变异速率; 另根据u=2μk计算u, μ为每个碱基的变异速率, k表示序列长度(bp)。 扩张时间T=t×世代时间,T值由Arelequin软件计算得到, 突变率μ参照前人研究[29], 采用1% per Myr (1×108)。

2 结果

2.1 赤水河半鳆的序列变异和单倍型系统发育关系

本研究得到了168条半鰐线粒体Cyt b基因序列, 比对后得到序列长度为1137 bp。序列中无碱基的插入和缺失。在168条序列中, 共有42个变异位点, 占总位点数的3.69%, 其中单突变位点有13个,占总位点数的1.14%, 简约信息位点有29个, 占总位点数的2.55%。

168个样本的平均碱基组成: A=27.5%, T=27.3%, C=29.1%, G=16.0%。A+T的含量为54.8%,C+G的含量为45.1%, A+T含量高于C+G的含量。G的含量最低, 碱基组成表现出了明显的偏倚, 这恰好符合脊椎动物线粒体DNA基因的共同特性。5个种群总体的单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.895±0.012和0.00487±0.00695, 表现出较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性。

168条序列共检测到38种单倍型(表 1)。其中,水潦种群22条序列检测到12个单倍型, 茅台镇种群45条序列检测到11个单倍型, 赤水市种群40条序列检测到25个单倍型, 二合镇种群39条序列检测到9个单倍型, 太平镇种群22条序列检测到10个单倍型。在所检测到的38个单倍型中, 单倍型Hap1、Hap2和Hap6的分布最广, 为全部种群所共享。其中有24个单倍型为某一个种群所独有, 其余11个单倍型则被2—4个种群共享。

图2 基于Cyt b序列构建的半鰐单倍型NJ树Fig. 2 Phylogenetic tree of haplotypes by NJ analysis based on Cyt b sequences

以鰐和蒙古鲌为外类群, 利用邻接法(Neighbor joining, NJ)和最大似然法(Maximum Likelihood,ML)构建单倍型系统发育树。结果显示两种方法做出的系统发育树拓扑结构一样, 以NJ树为例(图2)。38个单倍型大致可以分为5个谱系, 其中谱系1由Hap9、Hap33、Hap37等12个单倍型组成; 谱系2由Hap15、Hap13、Hap14、Hap21、Hap24, 5个单倍型组成; 谱系3由Hap18、Hap38、Hap17、Hap8、Hap32, 5个单倍型组成; 谱系4由Hap22、Hap6、Hap35等12个单倍型组成; 谱系5则由Hap23、Hap29、Hap12、Hap34, 4个单倍型组成。可以看到, 同一地点的单倍型没有聚为单系, 而是分散在不同的谱系中, 说明还没有出现种群的谱系分化。

利用Network软件, 以中接法构建的半鰐各单倍型进化网络图(图3), 结果表明: Hap1、Hap2、Hap6是5个地理种群的共享单倍型, Hap4是4个地理种群的共享单倍型。该单倍型关系图与系统发育树结果一致, 各单倍型相互散布在不同的地理种群中, 未形成明显的系统地理格局。

2.2 赤水河半鳆种群遗传结构和种群分化

种群遗传多样性和遗传距离从遗传多样性指数来看, 在这5个种群中, 赤水市的单倍型多样性最高, 为0.922±0.032, 茅台镇的单倍型多样性最低, 为0.842±0.032; 水潦的核苷酸多样性最高, 为0.00495±0.00434, 茅台镇的核苷酸多样性最低, 为0.00386±0.00342 (表 1)。

种群遗传结构和分化运用Arlequin 3.11软件进行种群间遗传分化(Fst)分析(表 2), 结果表明:赤水市种群与茅台镇种群、二合镇种群、水潦种群之间存在高度分化(Fst＞0.15), 且差异很显著(P=0.0000,P＜0.01), 赤水市种群与太平镇种群之间有中度遗传分化(Fst=0.11692, 0.05＜Fst＜0.15), 差异也很显著(P=0.0000,P＜0.01)。除赤水市种群外, 其他4个种群之间均未出现分化(Fst＜0.05)。

采用Mega 6.0 软件计算5个种群的遗传距离,5个种群之间的平均净遗传距离范围为0.004—0.006(表 3): 水潦种群和茅台镇种群之间的遗传距离为0.004, 水潦种群和二合镇种群之间的遗传距离为0.005, 水潦种群和太平镇种群之间的遗传距离为0.005, 水潦种群和赤水市种群之间的遗传距离为0.006, 茅台镇种群和二合镇种群之间的遗传距离为0.004, 茅台镇种群和太平镇种群之间的遗传距离为0.004, 茅台镇种群与赤水市种群之间的遗传距离为0.006, 二合镇种群和太平镇种群之间的遗传距离为0.005, 二合镇种群与赤水市种群之间的遗传距离为0.006, 太平镇种群和赤水市种群之间的距离为0.005。

将5个地理种群两组, 水潦、茅台镇、二合镇和太平镇为一组, 赤水市一组, 然后采用Arlequin 3.11软件进行分子方差分析(AMOVA)(表 4), 结果显示: 赤水河半鰐种群内存在较高的遗传变异(80.95%), 而组间变异占种群遗传变异的19.82%,组内种群间的变异占-0.77%, 由此可见, 赤水河半鰐的遗传变异主要来源于种群内部, 且在P=0.01水平上显著, 5个地理种群之间存在基因交流。

2.3 种群扩张及分化时间

使用Arlequin3.11软件对5个种群所有的168个半鰐个体进行Tajima’sD检验和Fu’sFs检验, 以及种群扩张时间的估算(表 5)。结果表明: Tajima’sD检验只有赤水市种群为负值, 但并未达到显著性水平(P=0.12100,P＞0.05)。在Fu’sFs检验中, 水潦种群、赤水市种群和太平镇种群的Fs值均为负, 但只有赤水市种群达到显著性水平(P=0.00000,P＜0.01)。以上结果表明, 水潦、太平镇和赤水市种群经历了种群扩张。采用1% per Myr的突变速率, 本研究推算出半鰐水潦种群、太平镇种群以及赤水市种群的大约扩张时间分别为0.43、0.40和0.37百万年前。

图3 半鰐各单倍型间的进化网络图Fig. 3 Statistical parsimony network based on cyt b haplotype frequencies of Hemiculterella sauvagei

表 2 基于Cyt b序列单倍型频率的半鳆种群成对Fst值(对角线下)和校正P值(对角线上)Tab. 2 F-Statistics (below diagonal)and Corrected P value (above diagonal)from haplotype frequencies of Hemiculterella sauvagei based on Cyt b gene

表 3 半鳆各地理种群间的遗传距离Tab. 3 The distances among 5 Hemiculterella sauvagei populations

表 4 基于线粒体cyt b基因对赤水河半鳆不同地理种群的AMOVA分析Tab. 4 AMOVA analysis for Hemiculterella sauvagei among different populations based on cyt b in the Chishui River

表 5 基于Cyt b基因的半鳆种群中性检验及种群扩张时间估算Tab. 5 Statistical tests for neutrality and time of expansion of Hemiculterella sauvagei based on Cyt b gene

3 讨论

3.1 半鳆种群遗传多样性

生物多样性包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性, 其中遗传多样性是物种多样性和生态系统多样性的基础, 也是生物多样性的核心和重要组成部分。核苷酸多样性(Pi)和单倍型多样性(Hd)是评价种群遗传多样性的重要指标, 其值越大,则种群的遗传多样性就越高。本研究中赤水河半鰐的Cytb基因的核苷酸多样性的范围为0.386%—0.495%, 与铜鱼(Coreius heterodon)(0.25%)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(0.092%)[30]、刀鲚(Coilia macrognathos)(0.185%—0.373%)[31]等种类相比,核苷酸多样性相对较高。整个半鰐种群的单倍型多样性均大于0.5, 核苷酸多样性均小于0.5%, 故表现出高的Hd值和低的Pi值。

3.2 半鳆地理种群的遗传分化

同一种鱼栖息在不同的环境中, 会造成鱼类基因流的限制或中断。遗传分化系数(Fst)是反映亚群间遗传分化的重要指标。Wright[32]认为: 若种群Fst为0—0.05, 则表明其各亚群间不存在分化; 若Fst为0.05—0.15, 则表明其各亚群间存在中度分化;若Fst为0.15—0.25, 则为高度分化。在本研究中的5个地理种群中, 赤水市种群和茅台镇种群、二合镇种群、水潦种群之间存在着高度的分化, 而与太平镇种群之间存在着中度分化。AMOVA结果表明, 种群内变异是遗传变异的主要来源, 并且存在显著差异(P＜0.01), 因此, 赤水市与其他4个地理种群之间存在着分化, 缺少基因交流。我们认为造成分化的可能原因是赤水市在地理位置上处于赤水河较下游地区, 而其他4个地方处于上游或中游, 因此他们之间可能存在着地理隔离, 而地理隔离又会造成生殖隔离, 从而造成不同地理种群的半鰐之间发生分化。

3.3 半鳆种群的历史动态

Grant和Bowen[33]提出了一个较简单的模式, 利用单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)来估计种群的进化历史, 当Hd≥0.5,Pi＜0.5%时, 是受瓶颈效应后种群数量的迅速扩张导致; 当Hd≥0.5,Pi≥0.5%时, 表示种群稳定, 具有比较悠久的进化历史;当Hd＜0.5,Pi≥0.5%时, 种群经历了轻微的瓶颈效应, 几乎没有影响到核苷酸变异; 当Hd＜0.5,Pi＜0.5%时, 表明种群近期经历了瓶颈效应。本研究中的5个地理种群的单倍型多样性都较高(Hd≥0.5), 而核苷酸多样性较低(Pi＜0.5%), 由于核苷酸多样性所需时间比积累单倍型所需的时间漫长, 这说明本研究中的五个地理种群的半鰐种群是从一个有效种群数量较小的种群, 经快速扩张而来的, 但是仍然没有达到积累核苷酸变异所需要的时间。整个半鰐种群的单倍型多样性较高, 而核苷酸多样性较低,这说明整个半鰐种群都是从较小的种群迅速扩张而来的[33—35]。

推测种群经历过的历史, 一般要用到Tajima’sD检验和Fu’sFs检验, Tajima’sD和Fu’sFs呈负值,并且在统计学上有较显著的标准, 则说明序列中含有比中性进化模型更多的核苷酸位点变化, 可能预示着被研究种群经历过一个扩张的历史[36,37]。本研究中只有赤水市种群的Tajima’sD值呈负值, 但不显著偏离中性检验(P＞0.5), 水潦、太平镇、赤水市种群的Fu’sFs值均呈负值, 但只有赤水市种群与中性进化的差异显著, 说明水潦、太平镇种群以及赤水市种群在历史上出现扩张。

3.4 关于赤水河半鳆的保护

半鰐是长江上游的特有鱼类之一, 在赤水河有分布。有文献记载, 半鰐分布于长江上游的干流,但主要集中在四川的西部[2,3]。但从近几年的渔获物调查中发现, 长江上游已很少有半鰐的踪迹。近些年赤水河的渔获物结果表明, 半鰐在2014—2015年的渔获物比重相比2014年以前有所下降, 原因可能为酷渔滥捕、水质污染、天然繁殖场遭到破坏以及其他环境条件改变等。

半鰐作为赤水河水生生态系统的重要组成部分, 对维系赤水河以及长江的生态系统结构完整和功能的正常发挥具有重要的意义。目前赤水河的半鰐资源减少, 对其进行保护刻不容缓。本研究结果显示, 赤水市种群与其他4个地理种群存在分化,所以在保护工作中, 应将他们作为两个不同的管理单元, 采取不同的保护措施进行保护, 应对赤水市种群采取重点保护。另外, 要在半鰐产卵期禁止捕鱼, 并对捕捞工具或网目大小做出明确的规定, 保证半鰐的生殖繁衍和资源恢复。

致谢：

感谢中国科学院水生生物研究所鱼类生态学与资源保护学科组工作人员在采样上给予帮助, 感谢唐琼英副研究员、巩政博士对文章修改提出的宝贵意见！

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