不同饵料对稀有鳇鲫仔稚鱼生长、消化道及消化酶的影响

赵月月 赵健蓉 胡佐灿 杨 洋 詹素平 刘小红 王志坚

(西南大学生命科学学院, 淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室 , 水产科学重庆市市级重点实验室, 重庆 400715)

稀有逗鲫(Gobiocypris rarus)俗名金白娘、墨线鱼, 隶属于鲤形目、鲤科、逗鲫属, 为我国特有鱼类。因具个体小、性成熟早、繁殖期短等特点,已经成为一种新的鱼类实验动物[1]。目前, 稀有逗鲫已经在鱼类免疫学、遗传学、环境科学等领域的研究中得到广泛应用[2—5]。

消化道是食物消化、吸收的场所, 对鱼类的生长发育和繁殖等重要生命活动有直接关系。研究消化道的组织形态结构, 是认识和探讨鱼类摄食、消化及吸收等生理机制的基础和途径之一[6]。仔稚鱼期间的饵料对于消化道的发育、鱼体的生长均有重要的影响。有学者认为仔稚鱼阶段幼鱼对人工饲料利用能力较差[7], 因此需要在鱼类早期发育阶段投喂活饵。活饵所提供的外源性消化酶可能对其生长和发育起到不可忽略的作用[8]。在消化系统发育趋于完善的过程中, 消化酶对于营养物质的消化吸收具有关键作用, 其活力是反映动物消化生理状况和对营养物质利用能力的重要指标[9,10]。目前关于稀有逗鲫早期生长发育已有一些研究[11—13],但至今仍缺乏遗传背景清晰的品种品系和标准化的养殖体系的建立; 本研究用3种不同饵料投喂稀有逗鲫仔稚鱼, 通过研究仔稚鱼消化道发育程度及消化酶活力, 以更深入了解饵料与消化道发育之间的关系, 从而为标准化养殖提供基础理论资料。

1 材料与方法

1.1 饵料及试验鱼

商业化微颗粒饲料和丰年虫(Artemia nauplii)卵分别购买于山东升索渔用饲料研究中心和山东爱家宠物水族用品有限公司, 商业化微颗粒饲料主要营养成分及氨基酸含量检测数据由北京市营养源研究所分析检测中心提供, 丰年虫相关数据参考黄权等[14]的研究结果(表 1、表 2)。

选取由淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室长期人工饲养的稀有逗鲫亲本8对[雌鱼体质量(0.97±0.17) g, 体全长(42.96±5.84) mm; 雄鱼体质量(0.82±0.26) g, 体全长(41.30±7.15) mm]。通过干法授精获取受精卵, 在室内进行人工孵化, 水温为(24±1)℃, 光周期为14L鲶10D, 溶氧量大于6.0 mg/L, 氨氮含量小于0.05 mg/L, 水体pH为6.5—7.0。将稀有逗鲫初孵仔鱼随机分为3个组: 活饵组、饲料组、转食组, 每组3个平行。活饵组投喂方式为: 从3 dah仔鱼开始一直投喂丰年虫; 饲料组投喂方式为: 3—22 dah投喂商业化微颗粒S1饲料(颗粒大小为150—250 μm), 23—35 dah投喂商业化微颗粒S3饲料(颗粒大小为480—750 μm); 转食组投喂方式为: 3—12 dah仔鱼投喂丰年虫, 13—22 dah混合投喂丰年虫和微颗粒S1饲料(每天增加10%微颗粒S1饲料, 减少10%丰年虫), 23 dah以后的仔稚鱼投喂S3饲料。1—2 dah因仔鱼未开口, 故不投喂。饲养期间每天饱食投喂3次, 投喂时间段为8:00—9:00、12:00—13:00、18:00—19:00, 每次投喂前清除缸内剩余饵料和粪便残渣。

表 1 微颗粒饲料和丰年虫的主要营养成分Tab. 1 Main nutrition components of micro-diet and Artemia nauplii (%)

表 2 微颗粒饲料和丰年虫的氨基酸组成(单位： %)Tab. 2 Amino acid components of micro-diet and Artemia nauplii

1.2 样品采集

在仔稚鱼10、15、20、25、30、35 dah时测量并记录生长指标, 并于35 dah时收集酶学和组织学材料。每组仔稚鱼经MS-222(Sigma, USA)麻醉, 迅速去头尾, 经液氮速冻后, 置于-80℃超低温冰箱保存, 用于进一步的消化酶活力测定。每组另取全鱼3尾, 波恩氏液(Bouin’s)固定24h后, 于70%酒精中暂存, 用于消化道组织学研究。

1.3 存活率和生长指标测定

用游标卡尺(精度0.01 mm)测量体全长; 用分析天平[奥豪斯AR2130, 奥豪斯国际贸易(上海)有限公司, 精度0. 001 g]测量体质量。根据记录和测量数据, 计算存活率(Survival rate,SR)、特定生长率(Specific growth rate,SGR)等生长指标。SR和SGR的计算公式如下:

式中Nt为终末尾数,N0为初始尾数,Mt为终末体质量(g),M0为初始体质量(g),T为时间(d)。

1.4 组织学研究

取波恩氏液(Bouin’s)固定后材料, 经梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 石蜡包埋, 切片(厚度为5 μm), 苏木精-伊红(Haematoxylin-eosin, HE)染色, 中性树胶封片, 于NIKON ECLIPSE 80i显微摄像系统(尼康公司, 日本)观察、照相, 并用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量。不同组别的仔稚鱼食道、前、中、后肠各取10张切片并随机选取10个视野, 分别测量每一视野中100 μm×100 μm范围内杯状细胞的总数, 作为杯状细胞的密度。

1.5 酶液制备和消化酶活力的测定

从-80℃冰箱中取出待测样品, 置于冰上解冻。解冻后将样品称重, 按重量(g)鲶体积(mL)=1鲶4加入预冷的匀浆稀释液(0.86%的氯化钠溶液), 匀浆。所得匀浆液用低温超速离心机(Sigma, USA)4℃, 3000 r/min离心20min, 取上清。BCA法检测蛋白浓度后, 根据试剂盒(南京建成生物工程公司, 南京)使用说明书的操作步骤, 用全波长酶标仪(Thermo, USA)或紫外分光光度计(UV-2450)检测各样品胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活力。

胰蛋白酶活力定义: 在pH 8.0, 37℃条件下, 紫外分光光度计在波长253 nm时测定, 将每毫克组织蛋白质中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003定义为1个酶活力单位。

脂肪酶活力单位定义: 在37℃条件下, 紫外分光光度计在波长420 nm时, 将每克组织蛋白在反应体系中与底物反应1min, 每消耗1 μmol底物定义为1个酶活力单位。

淀粉酶活力单位定义: 在37℃条件下, 紫外分光光度计在波长660 nm时测定, 将组织中每毫克蛋白与底物作用30min, 水解10 mg淀粉定义为1个酶活力单位。

1.6 数据处理与统计分析

数据均以平均值±标准误(Mean±SE)表示。用SPSS17.0统计分析软件进行分析。体全长、体质量采用双因素方差分析(Two-Way ANOVA)以及Duncan氏多重比较,P＜0.05定为差异显著。存活率、特定生长率及组织形态指数采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)及Duncan氏多重比较,P＜0.05定为差异显著。

2 结果

2.1 不同饵料对稀有鳇鲫仔稚鱼生长和存活率的影响

用3种不同饵料投喂后, 各组实验鱼在15、25和30 dah时的体全长均有显著性差异(P＜0.05),表现为活饵组最大, 饲料组最小; 在10、20和35 dah时, 表现为活饵组和转食组体全长显著高于饲料组(P＜0.05)。在15、25、30和35 dah时, 3组之间体质量也有显著性差异(P＜0.05), 表现为活饵组最大, 饲料组最小。在10和20 dah时, 活饵组与转食组体质量无显著性差异(P＞0.05), 均显著高于饲料组(P＜0.05)(图1)。经双因素方差分析, 日龄和投喂方式均对体质量和体全长的影响达到显著水平(P＜0.05), 且存在交互作用(P＜0.05)(表 3)。

在35 dah时, 各组仔稚鱼的特定生长率有显著性差异(P＜0.05), 表现为活饵组最高, 饲料组最低。活饵组与转食组仔稚鱼的存活率无显著性差异(P＞0.05), 均显著高于饲料组(P＜0.05)(图2)。

2.2 不同饵料对稀有鳇鲫仔稚鱼消化道结构的影响

35 dah稀有逗鲫仔稚鱼消化道由口咽腔、食道、前肠、中肠、后肠组成。消化道组织形态指数见表 4。

口咽腔口腔壁由黏膜层、黏膜下层、肌层组成。黏膜层由扁平上皮细胞、杯状细胞、味蕾等组成, 为复层扁平上皮。杯状细胞基本分布于黏膜层表层, 为梨形或椭圆形。味蕾呈不规则卵形或瓶形, 由长梭状细胞和圆锥形细胞组成, 顶端开口于口咽腔。黏膜下层由致密结缔组织构成, 与基膜层分界不明显。肌层发达, 由横纹肌组成(图版Ⅰ-a—c)。

食道食道由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜组成。黏膜层向管腔内凸出形成高低、大小不同的黏膜褶皱。黏膜上皮由复层扁平上皮细胞组成, 其表层主要由扁平上皮细胞和杯状细胞组成。杯状细胞呈梨形或椭圆形。黏膜下层由疏松结缔组织组成, 其间散布有横纹肌纤维束。肌层纵肌、环肌分界不明显。浆膜层极薄, 基本不可见(图版Ⅰ-d—f)。3组黏膜褶皱高度间无显著性差异(P＞0.05)。肌层厚度3组间有显著性差异(P＜0.05),活饵组最高, 饲料组最低。黏膜下层厚活饵组显著高于转食组(P＜0.05)。活饵组杯状细胞数目显著高于转食组(P＜0.05)。

图1 稀有逗鲫仔稚鱼体全长和体质量(N=15)Fig. 1 Total body length and body mass of larva and juvenile G.Rarus

表 3 日龄和投喂方式对稀有鳇鲫仔稚鱼体质量及体全长的影响Tab. 3 Effects of age in days and feeding ways on the total body length and body mass of larva and juvenile G. Rarus

前肠肠道基本与食道相同, 均由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜组成。黏膜层主要由柱状上皮细胞和杯状细胞组成, 黏膜层向管腔内折叠形成黏膜褶皱。杯状细胞基本分布在表层。黏膜下层由疏松结缔组织、淋巴管和血管组成。肌层由纵肌、环肌组成, 但分界不明显(图版Ⅰ-g—i)。活饵组黏膜褶皱高度和肌层厚度显著高于饲料组(P＜0.05)。三组间黏膜下层厚有显著性差异(P＜0.05), 转食组最高, 饲料组最低。活饵组杯状细胞数目显著高于饲料组和转食组(P＜0.05), 饲料组杯状细胞数目最少。

中肠中肠组织学结构与前肠基本相同, 均由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜组成(图版Ⅰ-j—l)。饲料组黏膜褶皱高度和肌层厚均显著低于活饵组和转食组(P＜0.05), 活饵组黏膜褶皱和肌层厚均最高, 饲料组黏膜褶皱和肌层厚均最低。活饵组黏膜下层厚度显著高于饲料组和转食组(P＜0.05)。三组间杯状细胞数目有显著性差异(P＜0.05), 活饵组最多, 饲料组最低。

图2 稀有逗鲫仔稚鱼存活率、特定生长率Fig. 2 Survival rate and specific growth rate of larva and juvenile G. Rarus

表 4 稀有鳇鲫仔稚鱼消化道组织形态指数Tab. 4 Morphometrical parameters in digestive tract of larva and G. Rarus

后肠后肠组织学结构与中肠基本相同, 均由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜组成(图版Ⅰ-m—o)。饲料组黏膜褶皱高度显著低于活饵组和转食组(P＜0.05), 活饵组最高。三组间肌层厚度有显著性差异(P＜0.05), 表现为活饵组最高, 饲料组最低。活饵组黏膜下层厚显著高于饲料组和转食组(P＜0.05), 饲料组最低。三组间杯状细胞数目有显著性差异(P＜0.05), 表现为活饵组最多, 饲料组最少。

2.3 不同饵料对稀有鳇鲫仔稚鱼消化酶活力的影响

实验鱼投喂至35 dah时, 三组间淀粉酶和脂肪酶比活力无显著性差异(P＞0.05); 活饵组和饲料组的胰蛋白酶比活力无显著性差异(P＞0.05), 均显著低于转食组(P＜0.05)(图3)。

图3 稀有逗鲫仔稚鱼消化酶活力Fig. 3 Activities of digestive enzymes of larva and G. rarus

3 讨论

3.1 不同饵料对稀有鳇鲫仔稚鱼存活率和生长的影响

一般认为, 仔鱼初次摄食外源性食物的时间、饵料种类、饵料大小、饵料密度等, 对仔鱼生长和存活起重要作用[15]。已有学者[16,17]使用与本研究相同的商业化饲料分别对大鳞副泥鳅和胭脂鱼仔稚鱼的生长发育进行研究, 前期均用丰年虫开口后转该饲料, 取得了较好的实验结果。这说明该商业化饲料基本能够满足鱼类正常生长发育营养需求,本研究中饲料组出现的负面作用不是因为营养需求达不到引起的。可能是因为稀有逗鲫初孵仔鱼偏小, 该饲料不是其良好的开口饵料所致。在稀有逗鲫仔稚鱼15 dah时, 从体全长和体质量上看, 已表现出活饵优于饲料和转食投喂, 此后基本保持这种趋势。在仔稚鱼35 dah时, 活饵组和转食组的存活率、特定生长率、体全长和体质量均显著高于饲料组, 表明在稀有逗鲫仔稚鱼时期, 用活饵作为开口饵料优于单一投喂饲料, 这与李芹等[9]以瓦氏黄颡鱼稚鱼为实验对象的研究结果一致。主动捕食的鱼类一般倾向于摄食运动着的饵料, 不喜欢摄食静止的饵料[18], 而本研究的实验对象为稀有逗鲫, 是一种捕食性鱼类[19]。实验所用饲料投入水中后, 随着时间推移, 饲料在水中会逐渐下沉, 而沉在底部的饵料仔稚鱼很少摄食, 这可能是造成单一投喂饲料的稀有逗鲫生长性能和存活率明显劣于投喂活饵和转食饲养的重要原因。另外, 从人工饲料和丰年虫一般营养成分含量可以看出, 丰年虫中粗蛋白质含量多于饲料, 而蛋白质对动物的生长发育有重要意义。这可能是造成一直投喂活饵的实验鱼生长性能表现优于另外两种投喂方式的原因。同时, 活饵组实验鱼具有最高的存活率和特定生长率, 也提示其具有更好的消化和吸收功能。

3.2 不同饵料对稀有鳇鲫消化道组织形态指数的影响

为了探讨活饵是否能促进稀有逗鲫仔稚鱼具有功能更强的消化道, 我们观察了分别投喂活饵、饲料和转食至35 dah实验鱼的消化道结构。

关于稀有逗鲫成鱼消化道的形态学、组织学已有较为详细的研究[20]。本研究发现, 稚鱼消化道结构与成鱼类似, 从前向后依次为口咽腔、食道、前肠、中肠、后肠。

稀有逗鲫食道黏膜层向管腔凸起形成纵形褶皱, 这些褶皱在食物通过时会变小或消失, 利于食物的通过。黏膜上层为复层扁平上皮, 有黏液细胞存在, 其中杯状细胞分泌的黏液可以润滑食物, 便于吞咽, 且可减少对食道的机械损伤[21]。肌层中环肌纵肌分界不明显, 但较为发达, 有利于其推动食物进入肠中消化。稀有逗鲫肠结构与食道类似, 均由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层构成[20]。肠内有褶皱, 褶皱可大大增加食糜在肠内停留的时间,促使消化液与食糜充分接触, 同时增加肠腔的表面积, 增大肠黏膜与食糜的接触面积, 提高营养的吸收效率[22,23]。可以认为肠内褶皱的高低与鱼类消化和吸收能力强弱有一定关系。肠内杯状细胞主要分泌黏蛋白和消化酶, 在前、中肠起着保护上皮细胞和消化食物的作用, 在后肠则润滑食物残渣,利于排出[21]。

在本研究中, 活饵组稀有逗鲫仔稚鱼食道、前肠、中肠和后肠的肌层厚度、杯状细胞数目均显著高于饲料组。食道的肌层较为发达、杯状细胞较多, 更便于吞咽、减少机械损伤。前肠和中肠主要起消化和吸收营养物质的作用, 其消化吸收营养物质的能力与杯状细胞数目有一定关系。后肠杯状细胞多, 分泌更多的黏蛋白, 利于食物残渣的排出。提示活饵组实验鱼消化道的发育程度更好, 具有更强的消化吸收功能。

3.3 不同饵料对稀有鳇鲫仔稚鱼消化酶活性的影响

饵料的营养成分构成鱼体消化酶的底物, 是引起消化酶种类、分布、分泌、活性发生变化的重要因素, 鱼类具有适应于不同的饵料而调整消化酶分泌的能力[24,25]。

有研究表明, 鱼类消化酶活性与饵料的成分密切相关, 如饵料中的碳水化合物的含量可诱导鱼类的淀粉酶活性的升高, 并且投喂人工饵料可以在一定程度上改变消化酶的分泌量[26,27]。关于饲料对淀粉酶活性的作用, 目前的结果尚不一致, 并缺乏深入的机理研究。对真鲷(Pagrosomus major)稚鱼的研究发现, 人工配合饲料可以促进实验鱼淀粉酶活性升高, 并且作者认为这种升高现象是食物诱导所致[28]。而饲料对史氏鲟(Acipenser schrencki)仔鱼的淀粉酶在消化中的影响并不明显[29]。在本研究中, 活饵、饲料或者转食对稀有逗鲫仔稚鱼淀粉酶活性均无明显影响, 与史氏鲟的研究结果相似, 这可能与鱼类遗传特异性有关[27], 具体原因还需深入研究。

目前关于饵料与脂肪酶活性关系的报道较多,但相关结果的结论也不一致。脂肪酶的活性是被三酸甘油酯所激活的, 它的活力与鱼类对饵料中脂肪的消化有关[30]。有学者认为脂肪酶的活性与饵料中脂肪含量有关。研究表明, 瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)稚鱼脂肪酶活性与饵料中的脂肪含量呈正相关关系[9], 表现出脂肪含量低的活饵组的脂肪酶活性显著低于脂肪含量高的饲料组。但相反的现象也存在, 如投喂脂肪含量高的饵料后, 真鲷脂肪酶活力反而会下降[28]。甚至也有学者认为,脂肪酶活性与饵料无关[31,32]。在本研究中, 分别投喂活饵、饲料和转食至35 dah的稀有逗鲫仔稚鱼脂肪酶活性无显著性差异, 结果与Nagase[31]和林浩然等[32]的研究一致。总体而言, 关于饵料与脂肪酶活性之间的关系有待更进一步研究。

很多学者认为, 胰蛋白酶活性与饵料中蛋白质含量有密切关系, 并进而影响仔稚鱼的摄食和生长[9,31,33,34]。活饵中的某些微量活性物质可能是胰蛋白酶分泌的诱导因子, 可能会促进胰腺的分泌功能[35]。但也有研究证明, 活饵刺激对仔稚鱼消化酶活性的影响几乎可以忽略不计[36,37]。关于饵料与胰蛋白酶之间的关系学者们一直存在争议。在本研究中, 经过转食处理后稀有逗鲫仔稚鱼胰蛋白酶活性显著高于投喂活饵和单一投喂饲料。由于丰年虫所含氨基酸存在不平衡的问题[14], 与饲料相比,氨基酸的总量较饲料低, 而鱼虾生长的限制性氨基酸[38]如甲硫氨酸, 在丰年虫中的含量明显低于人工饲料, 因此转食则可以弥补这一缺陷并导致出现本实验中所观察到的胰蛋白酶活性在转食组最高的现象。这提示单一投喂丰年虫可能对于需要大量蛋白质的生长期有一定弊端, 但由于仔稚鱼期的稀有逗鲫对蛋白质需求量不是很大, 因此单一投喂生物饵料或人工饲料并不影响其生长和发育, 均能满足仔稚鱼对蛋白质的需求。

结合存活率、生长和消化道发育总体分析, 活饵是仔稚鱼期稀有逗鲫的最佳饵料。建议在标准化养殖时针对仔稚鱼期的稀有逗鲫投喂活饵。但在稀有逗鲫幼鱼及成鱼期, 单一投喂活饵还能否满足其对营养物质的需求, 是否会对生长和繁殖产生不利影响还未知, 有待更进一步研究。

图版Ⅰ 稀有逗鲫仔稚鱼消化系统组织学观察PlateⅠ Histological observations of digestive system in juvenile G. rarus

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