环境激素睾丸酮和雌二醇对卜氏晶囊轮虫繁殖影响

刘露露 卢绪鑫 叶天韵 金司晨 闵元棋 韩亚杰 杨家新

(南京师范大学生命科学学院, 南京 210023)

轮虫是重要的淡水浮游生物类群, 由于其个体小, 生活史周期和世代时间短、生殖速度快, 自20世纪70年代初期开始, 轮虫被用作毒理学研究的重要受试动物[1,2], 如Buikema等[3]采用轮虫评价重金属离子的毒性, 并获得理想效果。目前, 生态毒理学方面的研究多集中在萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus), 而对捕食性晶囊轮虫, 如卜氏晶囊轮虫(Asplanchna brightwelli)作为实验动物研究生态毒理效应的报道尚不多见。目前, 针对晶囊轮虫的研究大多学者都集中于轮虫表型多态现象研究方面, Gilbert[4]发现西氏晶囊轮虫(Asplanchna sieboldi)在0.02 pg生育酚的诱导下会由正常的囊型个体(Saccate)转变为十字型个体(Cruciform)和钟型个体(Campanulate)。Birky[5]将雌体卜氏晶囊轮虫的形态分为α 型和β 型。由于卜氏晶囊轮虫个体比萼花臂尾轮虫大且行动缓慢易计数, 很多学者都建议将其作为水环境监测的指示生物。

睾丸酮与雌二醇是由脊椎动物分泌的类固醇激素, 进入水体会对浮游生物产生内分泌干扰。近年来, 国内外已有若干关于环境激素对轮虫影响的研究[6,7], 如Radix等[8]发现当睾丸酮浓度高于0.58 μmol/L时, 萼花臂尾轮虫内禀增长率r会显著下降。2种多溴二苯醚BDE-47和BDE-209均促进褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)性成熟, 其中BDE-47显著抑制其繁殖力, BDE-209显著提高其繁殖力[9]。Huang等[10]发现狄氏剂浓度为0.001—100 μg/L,17β-雌二醇浓度为0.001、0.01、1、100和1000 μg/L时, 可显著延长萼花臂尾轮虫轮虫的繁殖期(P＜0.01)。然而关于环境激素对卜氏晶囊轮虫生长生殖的影响鲜有报道。

本文以卜氏晶囊轮虫为受试动物, 旨在探讨在睾丸酮、雌二醇等典型类固醇激素对卜氏晶囊轮虫生殖的影响, 分析捕食性种类-晶囊轮虫对环境内分泌干扰物的敏感性和可靠性, 为利用轮虫作为受试动物, 开展环境激素风险评估和评价提供新的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料的培养

实验采用卜氏晶囊轮虫, 体长: 500—800 μm,来自南京采月湖(32°6′35.24″N, 118°18′32.71″E)。在解剖镜下挑取活力旺盛的非混交雌体作为起始材料, 在实验室条件下以EPA(去离子水配制, 含96 mg/L NaHCO3, 60 mg/L CaSO4· 2H2O, 60 mg/L MgSO4, 4 mg/L KCl, pH 7.5左右)为培养基进行单个体“克隆”培养[11]。培养光照强度约4000 lx, 昼长比L鲶D=12鲶12, 温度(25±5)℃, 每天投喂萼花臂尾轮虫为食物, 食物密度大于50个/mL, 每天投喂2次。萼花臂尾轮虫使用浓缩蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)培养, 蛋白核小球藻培养方式同杨家新和黄祥飞[12]。

1.2 试验药品的配置

睾丸酮和雌二醇(纯度均＞98%)购于Sigma-Aldrich公司。采用丙酮(分析纯)为助溶剂, 分别将睾丸酮、雌二醇配置为10000 mg/L的母液, 再用EPA培养基稀释为不同浓度梯度的实验溶液。

1.3 急性毒性实验

利用1.2母液, 分别配制不同浓度(5、10、15和20 mg/L)的睾丸酮和雌二醇, 随机挑取300只非混交雌体幼体(龄期＜4h), 分别放入6孔板中培养, 每孔添加5 mL实验液, 随机加入10只个体。每12h观察1次, 24h更换培养基。根据几率单位法计算48hLC50。每组设6个平行及1个对照组。

1.4 激素单一作用效应实验

睾丸酮、雌二醇对卜氏晶囊轮虫生殖和寿命的影响随机挑取单个活泼健壮的新生幼体(＜4h), 移入24孔板中培养, 每孔加入1 mL浓度为0.5、1、2、4和8 mg/L的实验液。每4—6h观察1次, 24h更换培养基。记录轮虫第一次产幼时间、后代幼体个数以及母体存活数。移除刚出生幼体,实验至全部个体死亡为止。每组设12个平行及1个对照组。其他培养条件同1.1。

睾丸酮、雌二醇对卜氏晶囊轮虫种群增长率的影响随机挑取龄期小于4h的非混交雌体于6孔板中, 每孔4只并加入4 mL实验液。每组设6个平行及1个对照组。药品浓度与培养方法同上。

1.5 睾丸酮和雌二醇组合效应实验

睾丸酮和雌二醇组合定量(8 mg/L)对卜氏晶囊轮虫生殖、寿命影响根据预实验, 睾丸酮与雌二醇浓度为8 mg/L时对卜氏晶囊轮虫生长抑制最为明显, 设置组合总实验浓度为8 mg/L。将睾丸酮和雌二醇按以下方案进行混合: T表示睾丸酮, E表示雌二醇, 下标为浓度(单位mg/L), 具体组合如下:T0E8、T2E6、T4E4、T6E2和T8E0, 另设置一个对照组T0E0, 每组12个平行。

睾丸酮和雌二醇组合定量(8 mg/L)对卜氏晶囊轮虫种群增长率的影响随机挑取龄期小于4h的非混交雌体于6孔板中, 每孔4只并加入4 mL实验液。每组设6个平行及1个对照组。药品浓度与培养方法同上。

1.6 数据处理与分析

种群增长率:r=(lnNt-lnN0)/tNt为种群在t时的种群数量,N0为起始数量,T为试验时间。采用SPSS 16.0统计软件包对实验数据进行单因素方差分析(One Way ANOVA)。

2 结果

2.1 睾丸酮、雌二醇的急性毒性实验

如图1、图2, 卜氏晶囊轮虫暴露在5、10、15和20 mg/L浓度组梯度的睾丸酮中, 处理48h, 其死亡率分别为31.30%、43.80%、70.80% 和72.90%,运用概率单位法求得睾丸酮对卜氏晶囊轮虫的48hLC50为9.56 mg/L, 直线回归方程为Y=1.98X+3.06(R2=0.92), 95%置信限为2.74—33.40 mg/L。

卜氏晶囊轮虫暴露在5、10、15和20 mg/L雌二醇浓度处理48h, 其死亡率分别为28.30%、50.00%、78.30% 和95.00%, 运用概率单位法求得雌二醇对卜氏晶囊轮虫的48hLC50为8.18 mg/L, 直线回归方程为Y=3.53X+1.78 (R2=0.92), 95%置信限为3.07—21.77 mg/L。由以上结果可看出随睾丸酮与雌二醇浓度升高, 轮虫死亡率呈上升趋势。

图1 睾丸酮浓度对数与轮虫死亡几率的关系Fig. 1 The relationship between probability and logarithmic of testosterone concentrations

图2 雌二醇浓度对数与轮虫死亡几率的关系Fig. 2 The relationship between probability and logarithmic of estradiol concentrations

2.2 睾丸酮和雌二醇对卜氏晶囊轮虫生殖、寿命的影响

在睾丸酮处理后, 卜氏晶囊轮虫平均寿命和后代个体数均受到显著影响(表 1)。方差分析显示,生殖前期在8 mg/L时, 比对照组显著延长11.71%(P＜0.05), 其他组无显著性变化(P＞0.05)。除0.5 mg/L浓度组之外, 其余各处理组的平均寿命显著缩短、后代个体数明显减少(P＜0.05)。与对照组相比, 睾丸酮浓度为1、2、4和8 mg/L时, 平均寿命分别缩短21.91%、35.61%、35.00%和52.22%;后代个数分别降低31.63%、69.22%、60.51%和82.20%, 差异显著(P＜0.05)。

方差分析显示, 雌二醇为4和8 mg/L处理组的生殖前期比对照组分别延长6.74% 和7.10%(P＜0.05)。与对照组相比, 各处理组表现出轮虫寿命缩短和后代个体数减少现象。雌二醇浓度为0.5、1、2、4和8 mg/L时, 轮虫平均寿命分别缩短21.49%、27.72%、34.58%、39.09%和49.75%; 后代个数分别降低24.44%、38.67%、46.22%、49.44%和80.33%, 各处理间差异显著(P＜0.05)。

2.3 睾丸酮、雌二醇对卜氏晶囊轮虫种群增长率的影响

由图3可以看出, 睾丸酮对卜氏晶囊轮虫的种群增长率有显著影响, 在总体上, 随着睾丸酮浓度升高,r值呈现下降趋势, 其中第4天组间差异最为明显(F=20.17,df组间=5,df组内=66,P＜0.001)。 与对照组相比, 第4天睾丸酮浓度为4和8 mg/L时, 种群增长率为0.74和0.55, 分别比对照组下降10.77%和33.58%, 差异极其显著(P＜0.01)。

雌二醇处理组与睾丸酮较为相似(图4), 卜氏晶囊轮虫种群增长率呈现显著差异, 总体上随着雌二醇浓度升高,r值呈现下降趋势, 其中第4天组间差异最为明显(F=25.81,df组间=5,df组内=66,P＜0.001)。与对照组相比, 第4天睾丸酮浓度为1、4和8 mg/L时, 种群增长率为0.80、0.74和0.61, 分别比对照组下降12.92%、18.70%和33.53%, 差异显著(P＜0.05)。

2.4 睾丸酮和雌二醇组合对卜氏晶囊轮虫生殖、寿命影响

睾丸酮与雌二醇组合对卜氏晶囊轮虫生殖前期、平均寿命和后代个体数有显著影响(表 2)。方差分析显示, 药物浓度为T0E8、T2E6和T8E0mg/L时,生殖前期显著延长, 分别比对照组延长34.17%、48.01%和43.57%(P＜0.05), 其他组无显著性变化(P＞0.05)。组合浓度为T0E8、T2E6、T4E4、T6E2和T8E0时, 轮虫平均寿命比对照组分别缩短32.53%、42.12%、31.56%、35.33%和37.73%; 后代个数则分别减少87.89%、89.78%、78.67%、85.22%和86.11%, 差异极其显著(P＜0.001)。

表 1 睾丸酮和雌二醇对卜氏晶囊轮虫生殖前期、平均寿命与产出后代个数的影响Tab. 1 The effect of testosterone and estradiol on pre-reproductive period, mean lifespan and fecundity of Asplanchna brightwelli under different concentrations

由表 1、表 2可看出, 8 mg/L睾丸酮的生殖前期为(35.00±1.56)h, 后代个数为1.88 ± 0.35, 组合处理组T0E8、T2E6和T8E0轮虫的生殖前期分别较其延长19.14%、31.43%和27.51%, 产出后代个数分别减少42.01%、51.06%和33.51%; 8 mg/L雌二醇的生殖前期为33.20±0.84, 后代个数为1.77±0.32, 处理组T0E8、T2E6和T8E0的生殖前期分别延长25.60%、38.55%和34.43%; 产出后代个数分别减少38.42%、48.02%和29.38%。

图3 不同浓度睾丸酮对卜氏晶囊轮虫种群增长率的影响Fig. 3 The impact of testosterone with different concentrations on population growth rate of Asplanchna brightwelli

图4 不同浓度雌二醇对卜氏晶囊轮虫种群增长率的影响Fig. 4 The impact of estradiol with different concentration on the population growth rate of Asplanchna brightwelli

2.5 睾丸酮和雌二醇组合对卜氏晶囊轮虫种群增长率的影响

由图5可以看出, 睾丸酮和雌二醇组合对卜氏晶囊轮虫的种群增长率的影响显著, 总体上, 随着组合中雌二醇睾丸酮浓度升高,r值呈下降趋势, 其中第5天, 组间差异最为明显(F=9.71,df组间=5,df组内=62,P＜0.001)。与对照组相比, 第5天, 浓度组为T6E2、T4E4、T8E0、T0E8和T2E6mg/L的种群增长率分别为0.49、0.44、0.41、0.28和0.24, 分别比对照组减少30.00%、37.14%、41.43%、60.00%和65.71%, 差异极其显著(P＜0.01)。由此可见, 在睾丸酮与雌二醇组合中, 雌二醇对卜氏晶囊轮虫种群存活和繁殖影响更大, 两者表现出显著的协同作用。

3 讨论

3.1 睾丸酮和雌二醇单一作用下对卜氏晶囊轮虫生殖和种群增长的影响

许多浮游动物早期生命阶段对毒物的敏感性较晚期发育阶段高, 胚胎发育历时在轮虫、枝角类和桡足类都被认为是比较敏感性的指标之一[13,14]。生殖前期是轮虫性成熟标志, 与平均寿命和后代个体数目作为生活史特征参数来检测环境激素具有重要意义。Halbach[15]提出环境激素会降低机体对食物摄取、减缓游泳速度以及通过影响各生活史阶段历时和产卵量, 进而影响轮虫的种群动态。Marcial等[14]研究发现, 当敌匹硫磷浓度高于2.5 mg/L时, 褶皱臂尾轮虫第一次产幼时间显著滞后, 高于5 mg/L时, 延迟其产卵时间并显著缩短其平均寿命。朱玮阁等[16]研究发现1和5 μg/LTBTC能显著延长萼花臂尾轮虫生殖前期并缩短其平均寿命。本实验结果表明, 环境雄激素睾丸酮和雌性激素雌二醇在1—8 mg/L内均能降低卜氏晶囊轮虫种群增长率、减少产出后代个体数目、缩短平均寿命, 且表现出明显剂量效应, 这与以往观察结果相近[14,16,17]。比较产出后代个体数目发现, 各处理组后代个体数仅相当于对照组的15%—70%, 这意味着睾丸酮和雌二醇对卜氏晶囊轮虫的性成熟和生殖行为存在明显的干扰作用。

表 2 睾丸酮和雌二醇组合定量(8 mg/L)对卜氏晶囊轮虫生殖前期、平均寿命与产出后代个数的影响Tab. 2 The effect of testosterone and estradiol on pre-reproductive period, mean lifespan and fecundity of Asplanchna brightwelli with a total concentration of 8 mg/L

国内外关于环境因子和污染物(如除草剂、杀虫剂和重金属等)对轮虫存活率和繁殖率的研究已有若干报道, 但对利用轮虫评价环境激素类污染物的报道尚不多见。Radix等[8]研究发现, 当乙炔雌二醇和睾丸酮浓度分别高于1.72和8.88 μmol/L时, 萼花臂尾轮虫的内禀增长率显著下降。 柯丽霞等[18]研究发现100 μg/L 17β-雌二醇显著提高萼花臂尾轮虫种群增长率, 1000 μg/L时显著降低其休眠卵产量。许多学者认为, 轮虫孤雌生殖的过程中生殖前期历时和胚胎发育时间会影响其种群增长速率, 生殖前期的延长会导致种群增长率降低[19,20]。Gama-Flores等[21]认为轮虫暴露时间和浓度对种群增长有重要影响。本实验结果显示睾丸酮和雌二醇浓度高于1 mg/L时, 随暴露时间的延长, 卜氏晶囊轮虫种群增长率呈下降趋势, 且浓度越高抑制作用越明显。卜氏晶囊轮虫生殖前期对睾丸酮和雌二醇的反应并不敏感, 平均寿命与后代个体数目间接反应种群增长率的变化, 这与以往的研究结果较为一致[21]。轮虫繁殖能力下降不仅与其生殖前期延长, 进而导致生殖期缩短, 同时还可能是因为高浓度剂量睾丸酮和雌二醇对轮虫生理机能产生了影响, 干扰其内分泌系统正常机能, 对其种群增长产生的不利影响。这种激素效应是否会随食物链传递到高营养级的鱼类尚不得而知, 因此, 利用卜氏晶囊轮虫作为环境激素检测的标志动物具有潜在应用价值[22]。

图5 睾丸酮和雌二醇联合定量(8 mg/L)对卜氏晶囊轮虫种群增长率的影响Fig. 5 The impact of testosterone and estradiol (8 mg/L) on the population growth rate of A.brightwelli

3.2 睾丸酮与雌二醇组合作用下对卜氏晶囊轮虫生殖和种群增长的影响

在自然界中, 环境污染物影响着物种丰富度、多样性和生态系统功能, 它们往往是联合发挥作用,目前关于单一环境激素对轮虫生殖影响研究的报道很多, 但以组合形式对轮虫的研究的却很少[23]。Gallardo等[24,25]提出50 mg/L γ-氨基丁酸、0.0025和0.025 IU/mL生长激素、0.25和2.50 IU/mL人体绒毛膜促性腺激素释放激素以及5 mg/L 5-羟色胺联合能显著提高褶皱臂尾轮虫种群增长率。张辉等[26]以鲫(Carassius auratus)血浆卵黄蛋白为指标并借助数学模型, 得出17β-雌二醇和双酚A毒性固定比例混合物的剂量-效应关系, 发现混合物的效应取决于化合物的性质、暴露剂和质量比例, 为环境内分泌干扰物在水生生物中的作用机理提供了很好的科学依据。睾丸酮是生物中主要的雄性激素, 是类固醇物质[27]; 雌二醇同样是类固醇物质, 在雌性生殖中是重要生长激素, 它保持卵母细胞的活力,又能阻止精细胞的凋亡[28]。杨家新等[29]提出睾丸酮和孕酮组合定量为1000 μg/L时, 能显著提高萼花臂尾轮虫的种群增长率。本研究发现, 与睾丸酮和雌二醇单一浓度为8 mg/L相比, 两激素组合定量(8 mg/L)中各处理组的生殖前期显著延长, 后代个体数目显著减少, 种群增长率显著降低。整体上表现出在组合中随雌二醇浓度增高, 对轮虫生殖抑制越明显,其中T2E6浓度组最为显著, 这表明卜氏晶囊轮虫对雌二醇更为敏感, 并且2种药品呈现出协同作用。

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