我国新记录海链藻属物种的形态学和系统学研究

郭雅琼 李 扬

(华南师范大学生命科学学院, 广州市亚热带生物多样性与环境生物监测重点实验室, 广州 510631)

海链藻属ThalassiosiraCleve是硅藻中的一个典型大属, 广泛分布于全球各类水体中[1,2]。绝大多数海链藻属物种的细胞个体微小[1,2], 但它们却是海洋生态系统中最主要的初级生产者[3,4], 也是常见的藻华物种[5,6]。此外, 一些海链藻属物种还是很好的模式生物, 广泛应用于硅藻基因组、有性繁殖生活史、群落和个体生理生态等多方面的研究[7, 8]。

本文通过建立海链藻单克隆培养株系, 结合形态学和分子生物学数据, 报道了我国海链藻属的2个新记录种, 分别是狭线形海链藻T. anguste-lineata(Schmidt) Fryxell & Hasle和碟形海链藻T. minicosmicaLee & Park。同时还扩增了其核糖体大亚基高变区序列, 基于分子系统树, 针对海链藻属的系统学研究展开了分析。

1 材料与方法

1.1 单克隆培养株系的建立

利用浮游植物网(孔径10 μm)进行水平拖网, 然后尽快带回实验室。在生物倒置显微镜(Mshot MI-12)下, 利用毛细管复洗技术对目标藻细胞进行分离, 之后转移至预先装有L培养基的48孔细胞培养板内[14], 置于培养室内培育。培养条件为: 光照强度约50—80 μmol photons/(m2·s)、光周期12h鲶12h,温度(20±2)℃。经过5—7d培养后, 观察其生长状况, 待细胞个数达到100个以上, 再转移到装有L培养基的100 mL锥形瓶中, 继续扩大培养。具体藻株信息详见表 1。

表 1 本文建立的目标藻株信息Tab. 1 The information of established monoclonal strains in this study

1.2 形态学特征的观察

光学显微镜(Light Microscopy, LM)观察: 取0.1 mL对数生长期藻液, 利用Olympus BX53进行微分干涉(Differential interference contrast, DIC)的观察, 并使用Olympus DP27数码相机拍照, 在Olympus CellSens软件上获取图像信息。主要观察特征有: 群体特征、细胞色素体形态等。

扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy, SEM)观察: 取1 mL对数生长期藻液, 加入等体积的浓硫酸(＞95%), 酸化以去除有机质, 然后用蒸馏水多次水洗至中性[3]。用20 mL注射器吸取适量样品, 并过滤至5 μm微孔滤膜上。取出滤膜, 自然晾干后, 用碳导电胶贴于SEM样品台上, 喷金后即可置于扫描电镜(Zeiss Ultra 55)下观察和拍照。另外, 为了避免酸化对一些有机结构的破坏, 本文还准备了未经酸化处理的电镜样品, 即直接用毛细管吸取目标细胞并吹在滤膜上, 待干燥之后直接喷金观察。主要观察特征有: 各类突起的形态和结构、孔纹特征、内壳面筛板膜结构等。

1.3 分子系统学分析

离心法收集对数生长期藻细胞, 并提取总DNA[15]。利用引物D1R-F[16]和D3B-R[17]扩增核糖体大亚基编码基因(Large subunit ribosomal encoding gene, LSU)的D1—D3区序列。PCR产物送往上海立菲生物科技有限公司进行纯化和测序。

从NCBI下载海链藻属物种及其邻近属种的LSU nrDNA序列信息。参考以往文献[18], 选择克罗丽纹藻Lampriscus kittonii、锤状中鼓藻Bellero-

chea malleus、平滑井字藻Eunotogramma laevis、布氏双尾藻Ditylum brightwellii、波状石丝藻Lithodesmium undulatum为外类群。运用BioEdit软件进行序列的比对和矩阵[19], 共有551个碱基用于最终的分析。基于MrModeltest 2.3[20]计算, 选择的最适模型和参数为GTR+I+G ([AC=1.0449], [AG=3.4071], [AT=1.7247], [CG]=0.4855, [CT]=5.9824,[GT]=1.0000, gamma shape=0.5318, nucleotide frequencies: A=0.2099, C=0.2194, G=0.3136, T=0.2574), 用MrBayes 3.2[21]构建贝叶斯推理树(Bayesian Inference, BI)。

2 结果

2.1 形态学描述

狭线形海链藻Thalassiosira anguste-lineata(Schmidt) Fryxell & Hasle(图版Ⅰ—Ⅱ)

员工除了掌握本科室的专业知识外，还要了解相关科室工作情况，以便更好地掌握全面的专业知识，为开展工作打好基础，从而更好地服务孤残儿童。如：抽派特殊教育老师和康复医师参加孤残儿童护理员培训；挑选康复骨干参加关于培智特殊教育课程和教学方面的培训；选派特殊教育老师参加儿童作业治疗康复培训等。通过跨专业的培训，员工在本职岗位工作中不断融入其他相关专业理念和方法，大大提高了服务水平。特殊教育注重孤残儿童生活适应，配合康复目标。康复训练与生活、教育相结合，使康复内容更为丰富，更贴近生活，为孤残儿童的康复提供了更为有利的条件。保育配合康复、教育的目标，巩固教育和康复的成果。

Fryxell & Hasle 1977, p. 73, figs 22—34; Hoppenrathet al. 2007, p. 274, figs 6—7.

在培养条件下, 细胞呈紧密相连的长链状群体(图版Ⅰ-1、2), 未见多条胶质丝相连的链状群体。壳面规则圆形(图版Ⅰ-3), 细胞内布满圆形、椭圆形以及不规则形色素体(图版Ⅰ-3), 直径为25.0—27.0 μm。环面观呈矩形(图版Ⅰ-2)。壳面孔纹呈切线状排列(图版Ⅱ-1), 密度为每10 μm内13—16个。壳套高度为4—5个孔纹(图版Ⅱ-7), 密度为每10 μm内19—23个。壳面中央区至壳缘的一半处分布有若干支持突, 无外管(图版Ⅱ-3), 基部有3—5个围孔(图版Ⅱ-4)。该支持突排列方式较为多变(图版Ⅱ-3、4), 围绕壳面中心点形成正六边形时(图版Ⅱ-3), 每个角仅有1个支持突; 而呈现近似正五边形时(图版Ⅱ-4), 其中一个角为2个较为靠近的支持突, 其余均为1个近中央支持突。壳面近中央处有1个中央大孔(图版Ⅱ-3、4)。1环壳缘支持突(图版Ⅱ-1、2), 基部有4个围孔(图版Ⅱ-6), 密度为每10 μm内3—4个。但是该壳缘支持突分布不均匀(图版Ⅱ-1、2), 可见有2个壳缘支持突紧密相邻(图版Ⅱ-7), 其外管末端紧缩呈球状并且无明显的管状延伸(图版Ⅱ-5、7)。1个壳缘唇形突(图版Ⅱ-1、2、5、6), 位于2个壳缘支持突间并略微偏向其中1个(图版Ⅱ-1、2), 该唇形突的外管末端开口略微膨大(图版Ⅱ-5)。壳缘处无肋纹结构(图版Ⅱ-7)。

生境: 海洋浮游生活。

分布: 标本采自我国的黄海南部(31°59.959′ N,122°29.632′ E, 7月)。本种主要分布于北大西洋的温带[23—25]、太平洋[26]以及美国南部海域[27]。

碟形海链藻Thalassiosira minicosmicaLee &Park(图版Ⅲ—Ⅳ)

Park & Lee 2015, p. 164, figs 1—33.

大多数细胞单独生活(图版Ⅲ-2—4), 未见胶质状群体, 偶见两个细胞组成的短链群体(图版Ⅲ-1)。在自然样品中, 细胞环带的膜状结构有时有(图版Ⅲ-3, 图版Ⅳ-1)有时无(图版Ⅲ-1), 但在人工培养条件下, 该特征完全消失(图版Ⅲ-2、4)。

细胞壳面呈圆盘形(图版Ⅲ-3、4), 直径17.1—33.8 μm, 内含圆形或椭圆形色素体(图版Ⅲ),主要贴近细胞壁的内侧分布。细胞环面观呈鼓形(图版Ⅲ-1、2), 壳面隆起(图版Ⅳ-2)。壳面孔纹小而密, 呈束状(图版Ⅳ-3)或切线状(图版Ⅳ-1)排列。其中壳面中部孔纹相对较疏, 密度为每10 μm内16—22个; 壳面靠边缘处孔纹相对较密, 密度为每10 μm内21—24个。壳套与壳面的界限不明显, 壳套高度为3—5个孔纹(图版Ⅳ-1、2、7), 密度是每10 μm内29—40个。1个中央支持突(图版Ⅳ-5、6),无外管(图版Ⅳ-5), 基部具有4个围孔(图版Ⅳ-6), 内壳面可见与之相邻的1个中央较大孔纹(图版Ⅳ-6)。1环壳缘支持突(图版Ⅳ-1、3、4), 基部有4个围孔(图版Ⅳ-8), 密度为10 μm内4—5个, 有较细且明显的外管(图版Ⅳ-1—2、7)。壳缘处有1个唇形突(图版Ⅳ-1—4), 位于2个壳缘支持突间, 但是比壳缘支持突略靠近壳面中央2—3个孔纹。相较于壳缘支持突, 唇形突的外管更长且更宽(图版Ⅳ-2、7)。壳缘处无肋纹结构(图版Ⅳ-2)。

生境: 海洋浮游生活。

分布: 标本采自温州(5月)、青岛(9月)和香港(12月)海域。本种首次报道于韩国[28]。

2.2 基于LSU rDNA序列的分子系统学分析

本文基于LSU rDNA D1—D3区间序列构建了系统发育树(图1)。MC1557和MC1562的基因完全相同, 形态学鉴定为狭线形海链藻。而这2个株系在分子系统树上与一株狭线形海链藻聚为一支, 并具有较高的置信值(BPP＞0.90), 这表明分子系统树的结果也支持形态学鉴定的结论。但同时它们与这一株美国圣华金河株系(DQ512414)也存在5个碱基的遗传差异, 应该是不同地理株系之间的差异。

碟形海链藻首次记录于韩国[28], 但是最初的报道只对其形态学特征进行了研究, 并未提供任何分子序列信息。而本文建立的5个单克隆培养株系(MC369、MC372、MC544、MC1529以及MC1530)在形态学特征上完全符合之前报道的碟形海链藻,与此同时这5个株系具有完全相同的LSU nrDNA D1—D3序列, 因此我们将它们鉴定为碟形海链藻。Park和Lee[28]认为碟形海链藻与小字海链藻T.minuscula的形态特征最为相似, 但也存在一些差异。而本文所构建的系统发育树显示碟形海链藻与小字海链藻聚在了同一个大分支上, 并且具有较高的置信值(BPP＞0.90), 之后这2个种又进一步独立分成了2个小支, 说明它们在遗传学上存在差异,这也从分子系统学的角度验证了这2个物种之间的形态学区别。

2.3 海链藻属分子系统学的结构分析

现存的海链藻属典型形态特征是: (1)细胞壳面圆形; (2)壳缘具有支持突和唇形突, 少数物种还具有闭合突; (3)壳面孔纹呈六边形或多边形, 中央大孔贯穿内外壳面, 内壳面处有筛板膜覆盖[2]。但是从本文所构建的贝叶斯系统发育树(图1)可以看出,海链藻属物种并非聚类在一个分支上, 而是被骨条藻属Skeletonema、漂流藻属Planktoniella、小盘藻属Minidiscus、小环藻属Cyclotella等其他邻近藻属所分隔, 因此基于形态学建立的海链藻属并不是一个单系起源, 而是由多个并系类群所组成。此外,诺氏海链藻T. nordenskioeldii作为海链藻属的模式种, 其系统学位置对于整个海链藻属应具有重要的指示意义, 但是在系统树上该种仅与部分海链藻属物种聚在一个小分支上, 并且短棘藻属Detonula、小盘藻属Minidiscus、杆链藻属Bacterosira物种穿插其中。除此之外, 还有其他一些海链藻属物种的系统学位置较为特殊。如杰拉德海链藻T. guillardii和威氏海链藻T. weissflogii聚为独立的一支;假微型海链藻T. pseudonana与小环藻属物种聚在一起并且具有较高的置信值(BPP＞0.90); 结线形海链藻T. nodulolineata、狭线形海链藻以及地中海海链藻T. mediterranea位于同一个分支上, 但同时也被骨条藻属所分隔开。这些独立存在的小分支, 或许正是下一步海链藻属系统学研究的方向之一。

3 讨论

3.1 相似种的比较研究

图1 基于核糖体大亚基D1—D3区间序列构建的贝叶斯系统树Fig. 1 Molecular phylogenetic tree from Bayesian analysis inferred from sequences of D1—D3 region of LSU rRNA

狭线形海链藻与相似种的比较研究狭线形海链藻最明显的特征是壳面半中央区具有多个支持突, 并排列成环状, 同样具有这个特征的还有地中海海链藻、萨氏海链藻T. sackettii、威氏海链藻、杰拉德海链藻等[22,29,30]。狭线形海链藻与威氏海链藻、杰拉德海链的区别特征是前者为独立筛板膜, 后两者为连续筛板膜。此外, 狭线形海链藻壳缘支持突外管紧缩呈球状, 后两者则是开放的管状结构。狭线形海链藻与地中海海链藻的形态特征最为接近, 区别特征是: (1)壳面孔纹排列方式:狭线形海链藻为切线状排列, 地中海海链藻为束状并且有若干条放射状硅质肋纹; (2)筛板膜的形态特征: 狭线形海链藻是独立筛板膜, 地中海海链藻的壳面中部是连续筛板膜, 壳套处则为独立筛板膜;(3)半中央区支持突的排列方式: 狭线形海链藻有时会有2—3个支持突紧密相邻的情况, 但地中海海链藻则是单独分布; (4)半中央区支持突的位置: 狭线形海链藻的壳面支持突位于孔纹之间的硅质壁上,而地中海海链藻的则是取代了壳面孔纹的位置。

Mahood等[27]基于形态特征将狭线形海链藻与地中海海链藻、湖沼海链藻T. lacustris、辐射盐野藻Shionodiscus endoseriata(原辐射海链藻)划分为同一类群, 划分依据是它们的壳面半中央区具有一圈可变的支持突。威氏海链藻和杰拉德海链藻亦具有此特征, 但系统树上却显示它们并不与狭线形海链藻聚为一支, 而是独立聚在一个分支上。然而矛盾的是狭线形海链藻却与地中海海链藻聚在一个小分支上, 这说明它们之间的亲缘关系又是较为接近。但是目前由于缺少湖沼海链藻、萨氏海链藻等相关物种的分子信息, 所以难以判断具有壳面半中央区支持突的海链藻属物种是否为单起源。

之后Hernández-Becerril & Tapia Peña[26]根据壳面孔纹排列方式将狭线形海链藻与偏心海链藻T.eccentrica、厄氏盐野藻范氏变种Sh. oestrupiivar.venrickae(原厄氏海链藻范氏变种)、细孔海链藻T.punctifera、门迪海链藻T. mendiolana、对称海链藻T. symmetrica以上壳面孔纹偏心状排列的物种归为同一类群。然而分子树上显示狭线形海链藻与厄氏盐野藻范氏变种以及偏心海链藻的系统学位置相距甚远, 位于2个不同的大分支上, 说明它与厄氏盐野藻范氏变种以及偏心海链藻的亲缘关系较远, 同时这也表明壳面孔纹的排列方式不能作为海链藻属类群划分的依据。

碟形海链藻与相似种的比较研究碟形海链藻的显著特征是壳缘唇形突的位置比壳缘支持突更靠近壳面中央。在已报道的现生海链藻属物种中, 安达曼海链藻T. andamanica、小字海链藻、斑点海链藻T. punctigera、管状海链藻T. tubifera也具有此特征[31—35], 但是它们之间存在明显的形态学区别。首先, 安达曼海链藻、斑点海链藻和管状海链藻具有壳面支持突, 而碟形海链藻却不具有这一特征。其次, 碟形海链藻的壳缘支持突具有外管结构, 而斑点海链藻无外管; 碟形海链藻无闭合突结构, 而管状海链藻则有。就形态学特征而言, 小字海链藻与碟形海链藻最为接近, 它们都具有1环壳缘支持突, 无壳面支持突以及1个具有明显外管的壳缘唇形突, 且唇形突的位置比壳缘支持突更加远离壳缘。这2个种之间也具有一定的形态学差异:(1)小字海链藻的壳缘唇形突与1个独立的支持突相邻, 这也是小字海链藻的特有特征, 碟形海链藻并不具有; (2)碟形海链藻具有壳缘支持突外管, 而小字海链藻则无外管; (3)碟形海链藻的壳套高度为3—5个孔纹; 小字海链藻的壳套仅为1—2个孔纹高度。

以往研究建立了细弱海链藻复合群T. subtiliscomplex[32,35], 将具有胶质状群体的细弱海链藻、萎软海链藻T. mala、小字海链藻、斑点海链藻T.punctigera等12个海链藻属物种归于其中[31,32,36,37]。之后Park & Lee[28]在报道碟形海链藻时发现该种亦会形成胶质状群体(本文未观察到该群体特征), 遂将其归为细弱海链藻复合群, 同时基于形态学研究认为胶质状群体不能作为物种划分的依据, 于是对细弱海链藻复合群进行了重新定义, 并提出了细弱海链藻类群T. subtilisgroup这一概念, 将安达曼海链藻T. andamanica、双环海链藻T. diporocyclus、伦德海链藻T. lundiana、碟形海链藻、小字海链藻、斑点海链藻和细弱海链藻以上7种海链藻归为该类群。从本文所构建的系统发育树上也显示萎软海链藻和小字海链藻等具有胶质状群体的海链藻并不聚在一起, 而是与它们独立位于2个大的分支上, 这表明萎软海链藻与它们的亲缘关系相对较远, 所以这也从分子学角度验证了胶质状群体特征不能作为海链藻分类学体系的划分依据。此外, 斑点海链藻并不与小字海链藻、碟形海链藻、伦德海链藻聚在一起, 而是与偏心海链藻T. eccentric、圆海链藻T. gravida、膨胀海链藻T. tumida聚为了1个小分支, 并且具有较高的置信值(BPP＞0.90), 这表明斑点海链藻或与后3种海链藻的亲缘关系更为接近。但是目前, 由于缺乏安达曼海链藻等其余3种海链藻的分子信息, 所以并不能对该类群进行更为客观的分析。因此, 单纯的依靠形态学特征所建立的细弱海链藻类群是否成立, 还有待进一步的研究。

3.2 海链藻属的系统学研究

随着越来越多的海链藻属物种被报道, 部分学者开始尝试对海链藻属特定类群进行系统学修订。其中一些修订工作得到了广泛的认可, 例如:Alverson等[38]基于唇形突远离壳缘, 支持突具有较长内管而无外管, 将包括厄氏海链藻范氏变种、瑞兹海链藻T. ritscheri等在内的26个种划分出来, 并建立新属——盐野藻属Shinodiscus, 基于LSU nrDNA和SSU nrDNA的序列信息所建立的贝叶斯系统发育树中也支持这一藻属的建立[18]。然而, 也有一些修订工作并没有被普遍接受, 例如: Stachura-Suchoples和Williams根据筛板膜的连续性建立了连筛藻属Conticribra, 模式种为化石种: 三环连筛藻C. tricircularis, 同时他们也将具有连续筛板膜的现生种杰拉德海链藻、威氏海链藻、内华达海链藻T.nevadica修订至此属[39]。但是该属模式种的另一个显著特征是具有三环壳缘支持突, 而这一特征在其修订的现生海链藻中并不存在, 并且化石种分子数据的缺失也导致无法利用分子生物学技术去验证该属的成立是否客观。

迄今为止, 全球已报道的海链藻现生种约有170种, 而在NCBI上可查询到基因序列的海链藻属物种不过30种, 并且多数序列信息都是核糖体基因,分子数据的缺乏已成为制约海链藻属系统学研究的重要因素, 这也是今后研究的一个重要内容。

图版ⅠP l ateⅠ

图版ⅢPlateⅢ

图版ⅣPlateⅣ

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