固原鸡OVR基因部分SNPs位点检测及分布规律分析

丁 伟 岳彩娟 马丽娜 马小明 安克龙2 王秉龙3 额尔和花

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002；2.固原市彭阳县畜牧技术推广服务中心，宁夏固原 756500；3.固原市农业科学研究所，宁夏固原 756500）

卵母细胞卵黄生成受体（Occyte vitellogenesis receptor，OVR）介导极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）和卵黄生成素（vitellogenesis，VTG）到达卵母细胞，此受体最先发现结合 VLDL 或 VTG 而称为（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）受体[1-2]，卵泡膜上的极低密度脂蛋白受体VLDLR，结合母鸡肝脏合成的卵黄前体物极低密度脂蛋白（VLDL）和卵黄生成素（VTG），并转运进入卵母细胞，促进卵细胞的成熟。

在禽类，VLDLR（即OVR）主要存在于卵母细胞表面，与卵母细胞的生长密切相关，有研究表明[3-4]，VLDLR（即OVR）一个编码区的单碱基突变（G/C）引起的半胱氨酸突变为丝氨酸，导致VLDLR不能正常折叠，引起产蛋数急剧降低，甚至导致蛋鸡不育，也有研究发现VLDLR[2-4]（即OVR）突变与鸡开产日龄、哈氏单位、蛋黄重及蛋黄比例呈极显著及显著相关，为了改良固原鸡性成熟晚，开产日龄迟等问题，筛选了VLDLR即OVR基因的部分SNP位点进行了检测，为选育提高其产蛋性能提供分子标记辅助作用。

1 材料与方法

1.1 样本来源

宁夏固原市彭阳县朝那鸡良种繁育中心所饲养的固原鸡种鸡群及固原市农科所选育群白羽和黑羽乌骨鸡共230只，试验鸡群均翅下静脉采血约2ml，柠檬酸钠抗凝，置于冰盒，带回实验室-20℃保存用于DNA的提取。

1.2 主要实验仪器和设备

温度梯度PCR仪，德国 Eppendorf公司，5418型台式高速离心机，德国Eppendorf公司，凝胶成像系统，美国BIORAD公司，核酸浓度测定仪NanoDrop2000，Thermo Scientific，DYY-2型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂

1.3 实验方法

1.3.1 基因组 DNA 提取与引物设计

采用常规苯酚/氯仿/异戊醇抽提法从鸡全血中提取基因组DNA。根据 NCBI 和 UCSC 中鸡VLDLR基因即OVR基因全序列GenBank 登录号no：006127），并参考曹顶国[2][3][4]等人的研究使用 Primer 5.0 分别对外显子6的8467位点G/A突变，内含子17的13876位点A/G突变，内含子2的3967位点T/G 突变设计OVR基因SNP位点分析3对基因扩增引物，引物信息详见表1，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

表1 OVR基因片段扩增引物序列、产物大小及退火温度

1.3.2 PCR扩增及酶切检测

PCR扩增体系均为20μL：PCR Master Mix10μl，DNA模板（100ng·μL-1）1μL，上、下游引物（10μmol·L-1）各0.15μL，ddH2O补至20μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性40 s，退火45 s（各引物的退火温度见表1），72 ℃延伸45 s，33个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

引物e6F、e6R扩增产物用限制性内切酶 XBaI进行RFLP分析，引物IN17F、IN17R扩增产物用限制性内切酶MvaI酶进行RFLP分析，限制性内切酶酶切反应体系（总体积15uL）：XBaI（MvaI）0.5uL（10U·uL－1），10×BufferG.1uL，PCR产物8uL，ddH2O.5.5uL，37℃水浴过夜，2.2% 琼脂糖凝胶电泳（110V，15min）检测酶切产物。引物VLDLR-IN2L、VLDLR-IN2R扩增产物用限制性内切酶 HinfI进行RFLP分析，限制性内切酶酶切反应体系如上述，37℃水浴3h或过夜。

1.3.3 数据的统计分析

应用PopGen32软件分析每对引物PCR扩增产物的酶切基因型的频率、等位基因频率、观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He）、有效等位基因数（Effective allele numbers，Ne），多态信息含量（Polymorphism information content，PIC），检验Hardy-Weinberg 平衡定律。

2 结果与分析

2.1 PCR-RFLP检测

图1 引物e6F、e6R扩增产物

图2 引物e6F、e6R扩增产物酶切检测

用引物e6F、e6R扩增OVR（即VLDLR）基因的外显子6片段，结果如图1所示，扩增片段与目的片段长度（474bp）一致，且条带清晰特异性好，对PCR产物XBaI酶切检测OVR基因的外显子6的8467位点G/A突变，检测到AA基因型（474bp），BB基因型（273bp/201bp），AB基因型（474bp/273bp/201bp），AA型8467处碱基为GG，BB型8467处碱基为AA，而AB型8467处碱基为GA，酶切结果见图2。

图3 引物IN17F、IN17R扩增产物

图4 引物IN17F、IN17R扩增产物酶切检测

如以上图3所示，引物IN17F、IN17R扩增片段与目的片段长度（441bp）—致，且条带清晰特异性好，对PCR产物MvaI酶切检测结果如图4，OVR基因的内含子17的13876位点A/G突变检测到三种基因型，AA基因型（441bp），BB基因型（313bp/128bp），AB基因型（441bp/313bp/128bp）。AA型碱基为AA，BB型碱基为GG，而AB型碱基为GA。

图5 引物VLDLR-IN2L、VLDLR-IN2R扩增产物

图6 引物VLDLR-IN2L、VLDLR-IN2R扩增产物酶切检测

引物VLDLR-IN2L、VLDLR-IN2R扩增产物大小如图5所示与目的片段长度（718bp）一致，且条带清晰特异性好，对PCR产物进行内含子2HinfⅠ酶切检测，结果表现出1种基因型（265bp/453bp），在扩增片段265bp处有一个固定的HinfⅠ酶切位点外没检测到其他突变位点。

2.2 固原鸡OVR基因SNP位点遗传特性分析

2.2.1 固原鸡OVR基因SNP位点等位基因频率和基因型频率分析

从表2可知，固原鸡催OVR（即VLDLR）基因的外显子6片段8467位点G/A突变在固原鸡群体中等位基因A占优势，基因频率为0.84，AA基因型为优势基因型，所以该处固原鸡群体中主要以GG碱基为主，对OVR基因的内含子17的13876位点A/G处检测在固原鸡群体中等位基因B占优势，BB基因型为优势基因型，所以该处固原鸡群体中主要以GG碱基为主。固原鸡催OVR（即VLDLR）基因内含子2的3967位点T/G 突变处检测到1种基因型。

2.2.2 固原鸡OVR基因SNP位点遗传多态性分析

如表3所示，固原鸡催OVR（即VLDLR）基因的外显子6片段8467位点G/A突变卡方检测结果显示在固原群体中该位点处偏离了Hardy-Weinberg平衡状态，该位点为低度多态，低杂合度。而OVR基因的内含子17的13876位点A/G处卡方检测结果表明，在固原群体中该位点偏离了Hardy-Weinberg平衡状态，中度多态。

3 讨论

固原鸡是宁夏唯一的地方鸡品种资源，属优质地方肉蛋兼用鸡，又与甘肃静宁鸡合并称为静原鸡，主产区在甘肃省静宁县及宁夏回族自治区固原县。固原鸡就巢性非常强烈、性成熟晚，开产日龄晚，产蛋率低，对其产蛋等生产性状还没有进行针对性和系统性的选育。

已有研究表明[2-4]，鸡 VLDLR（即OVR）突变与鸡开产日龄、产蛋数量、蛋品质具有显著性的影响，固原鸡外显子6的8467位点G/A突变，内含子17的13876位点A/G突变，内含子2的3967位点T/G酶切检测及遗传多态性分析发现，外显子6片段8467位点G/A突变处固原鸡群体中主要以GG碱基为主，偏离了Hardy-Weinberg平衡状态，该位点为低度多态，低杂合度，说明所研究的基因位点群体遗传多态比较低。

表2 OVR基因部分SNPs基因型及等位基因频率

表3 OVR基因部分SNPs多态信息

而OVR基因的内含子17的13876位点A/G处，固原鸡群体中以GG碱基为主，为中度多态，杂合度也处在中度，说明所研究的基因位点在固原鸡群体中具有一定的遗传多态，具有一定的选择价值。

[1]曹顶国，周艳，雷秋霞，等.鸡VLDLR基因多态性与蛋黄性状的关联分析[J].畜牧兽医学报 2012，43（6）：849-856.

[2]詹慧琴.鸡产蛋相关基因的SNPs 检测及其与蛋用性能关系的研究[D].华中农业大学，2006.

[3]张丽萍，刘雅丽，熊化鑫，等.灵昆鸡VLDLR 和CTSD 基因多态性与产蛋性状的相关性研究[J].中国农学通报，2016，32（26）：6-14.

[4]陈国宏.中国禽类遗传资源[M].上海科学技术出版社，2004.