鹦鹉喙羽症（PBFD）研究进展

郭学俊,盖新娜

（中国农业大学动物医学院农业部动物流行病学重点实验室,北京 海淀 100193）

鹦鹉喙羽症（Psittacine beak and feather disease,PBFD）是由鹦鹉喙羽症病毒引起的一种全球性分布的高度传染性鸟类疫病,严重威胁着野生和宠物鹦鹉,尤其是濒危种属鹦鹉的生存与健康。该病以羽毛对称性脱落和萎缩、喙及爪畸形为主要临床特征,多发于雏鸟和青年鸟,成年鸟感染多呈隐性经过,是重要的潜在感染源。PBFDV感染能够导致动物体严重的免疫抑制,发病鹦鹉最终死于细菌性或病毒性继发感染[1]。目前还没有有效预防和治疗PBFD的方法。发病鹦鹉只能采取保健性治疗,为其营造较好的生存环境以延缓疾病的发展进程。

鹦鹉喙羽症病毒属于圆环病毒科圆环病毒属,是一种无折叠、不分节段、无囊膜的单股环状双义DNA病毒。病毒粒子呈二十面体对称,直径约20 nm,基因组大小约2 kb[2],由7个开放阅读框组成。其中,ORF1编码与病毒复制相关的蛋白（Rep蛋白）,具有ATP酶和GTP酶双重酶活性,在病毒整个复制过程中发挥着重要作用[3];ORF2编码病毒的主要结构蛋白-衣壳蛋白（Cap蛋白）,是圆环病毒主要的免疫保护性蛋白,也可能与病毒基因组及Rep蛋白的跨核膜核内转运有关[2-6]。这两个开放阅读框有着不同的进化速度,编码 Rep蛋白的ORF1通常比编码Cap蛋白的ORF2无论在核苷酸序列还是在氨基酸序列上都具有更高的保守性[7-8]。目前针对PBFDV的研究一直未能深入展开,除了因为该病原所引起的关注度较低之外,更重要的一个原因是截至目前PBFDV可复制性的体外培养仍没有获得成功,这在很大程度上阻碍了PBFDV的致病性研究及相关疫苗的开发。

1 临床症状

鹦鹉喙羽症多发于未离巢或离巢不久的幼龄鸟和青年鸟,发病时的临床表现以及机体损伤程度与鹦鹉的品种和年龄有很大关系[9]。PBFDV感染可分为显性感染和隐性感染。显性感染时的临床症状较明显,主要表现为幼鸟初羽生长期和青年鸟二次换羽期出现对称性羽毛脱落、萎缩,喙和爪畸形发育。其感染又可分为急性感染和慢性感染。急性感染的病例病程发展迅速,在表现出明显的临床症状之后数日内即死亡,临床当中并不多见[10]。慢性感染周期较长,发病鹦鹉在羽毛脱落、萎缩、喙爪畸形之后仍能存活数月甚至数年之久。

2 组织病理学变化

PBFDV感染不会对鹦鹉的肌肉和骨骼发育造成很大影响,仅发现患病鹦鹉的胸肌轻微发育不良,肝脏和脾脏轻微肿大并伴有坏死性的淤斑,腔上囊和胸腺有一定程度的肿胀变性,羽髓管质地柔软与皮肤贴合不紧密[11]。组织学病变主要表现在羽毛轴及相应上皮细胞的进行性坏死,表皮增生及角化过度;喙基底层及中上皮层上皮坏死、增生;羽髓化脓性炎症,表现为异嗜性细胞、浆细胞、巨噬细胞及个别淋巴细胞浸润。患病鹦鹉的胸腺及腔上囊淋巴组织萎缩,坏死灶聚集。在一些特急性病例中,感染致死鹦鹉仅表现为胸腺及腔上囊的严重坏死[12];胸腺、腔上囊及全身各处淋巴组织出现大面积细胞凋亡和上皮细胞脱落;肝脏中的巨噬细胞出现嗜碱性串珠状变性[13]。这些变化直接导致了机体的免疫抑制,再加上发病鹦鹉均存在严重的贫血和营养不良现象,PBFD对于鹦鹉来讲是致命的[12]。

3 病原传播与流行病学

鹦鹉喙羽症是一种高度传染性的地方流行性疫病,可水平传播,亦可垂直传播。个体间的直接接触、通过空气或者被污染的巢穴、接触感染鸟脱落的羽屑或者排泄物等都属于典型的水平传播方式。在野外开放条件下一般传播较缓慢,封闭空间（如海岛或拥挤的人工饲养环境）会加速PBFD的传播[13]。PBFDV还可以通过种蛋传播[14]。最近发现,鸟疥螨在PBFD的传播过程中也可能发挥着一定的作用。鸟疥螨能够携带PBFDV,通过个体转移实现PBFDV的传播[15]。

鹦鹉属鸟类主要分布于热带和亚热带地区,大部分鹦鹉都呈现明显的区域分布特征,如对PBFDV易感的非洲灰鹦鹉主要分布于南非等非洲国家,而凤头葵花鹦鹉则主要分布于澳洲及其周围群岛。不同鹦鹉品种对PBFDV的易感性差异及鹦鹉种属的区域性分布特点决定了PBFD的分布具有明显的地方流行性特征。用real-time PCR方法检测阿拉伯联合酋长国境内多个品种鹦鹉血液或羽毛样本中的PBFDV,结果显示,非洲灰鹦鹉、美冠鹦鹉、亚马逊鹦鹉、金刚鹦鹉群中PBFDV感染的阳性率分别为58.33%、34.42%、31.8%、25.53%[16]。 澳大利亚是全球最大的鹦鹉资源地,PBFD依旧是本土鹦鹉品种生存的首要威胁[17]。

早些年,仅澳洲地区报道了PBFD的大规模流行和暴发[17]。近几年,随着国际鸟类贸易的发展和鸟类走私的盛行,鹦鹉喙羽症已逐渐演变成为世界范围内流行的传染病[8]。而鹦鹉异源地繁育的不断出现及其基因杂交和突变进程的加快无疑推进了PBFD的进一步传播和流行[18]。欧洲和美国的鹦鹉进出口频繁,异源地繁育及饲养密度较高,这使得它们在PBFD的全球传播中扮演着重要的角色[19]。而起源于美洲、非洲和亚洲的圈养和野生鹦鹉种群的数量监控以及伴侣鸟类的全球贸易与新型PBFDV毒株在野生鹦鹉种群中扩散之间的内在关联应该是鹦鹉种群中PBFD流行病学研究的着眼点[20]。

4 诊断技术

随着PBFD在世界范围内的广泛流行及关注度的日益增加,其相应的鉴别诊断技术也不断更新发展。PCR技术具有高特异性和高敏感性,一直是PBFDV检测最常用的诊断手段,但操作过程较为繁琐,检测成本较高。以传统PCR技术为基础发展起来的巢式PCR具有更高的时效性和准确性[21]。而实时定量PCR技术的应用对于PBFDV的检测及毒株的基因分型起到了事半功倍的效果[22]。

另一种传统的PBFDV检测方法是血细胞凝集试验（HA）和血细胞凝集抑制试验（HI）。一般取病毒含量高的羽毛和排泄物进行红细胞凝集试验[23],取感染鹦鹉的红细胞进行血细胞凝集抑制试验[13]。HA和HI操作相对简便,在临床检测中也常常被用到,但其敏感性和特异性受干扰因素较多。

以重组表达蛋白和单克隆抗体为基础建立的抗原捕获ELISA使得PBFDV的抗原检测具有了更好的一致性,也更容易标准化。2018年,Chia-Fang Ho等利用识别Cap蛋白与Rep蛋白上保守性抗原表位的单克隆抗体,建立了一种抗Cap蛋白的抗原捕获ELISA,经临床样本验证,具有良好的特异性和敏感性,可以用于 PBFDV感染鸟类的快速鉴别诊断[13]。

5 PBFDV主要编码蛋白的表达

Cap蛋白是PBFDV完整病毒粒子中唯一暴露于表面的病毒结构蛋白,包含着病毒主要的抗原表位,是进行病毒免疫原性蛋白表达的主要靶蛋白。完整Cap蛋白的表达最早是在杆状病毒表达系统中实现的,将构建的杆状病毒感染Sf9细胞后,能够获得自我组装的病毒样颗粒（VLPs）,并具有一定的血凝活性[23]。另一个比较常用的是原核表达系统。Reimar Johne等在尝试全长表达不成功的情况下,将Cap蛋白基因进行截短,截短后表达的Cap蛋白具有良好的免疫反应性,以之为包被抗原建立的间接ELISA具有与HI相一致的检测特异性。而Cap蛋白氨基酸末端1～38位中的精氨酸残基可能是导致全长蛋白表达量低的主要原因[24]。利用亲和层析技术并使用含有甘油、巯基乙醇、Triton X-100、高浓度NaCl、pH值8缓冲液能够将Cap蛋白的表达量提高15～20倍之多[25]。Subir Sarker通过筛选表达载体和适宜的宿主菌、优化诱导条件及蛋白纯化工艺,获得了高纯度、高浓度、结构呈二十面体对称、具有良好抗原性的重组Cap蛋白,可作为潜在的DNA疫苗及诊断试剂,并用于病毒的结构与功能研究[26]。而利用植物表达系统,也获得了组装成VLPs的PBFDV Cap蛋白,尽管产量有待于进一步提高[27]。

PBFDV另一个主要的编码蛋白是与复制相关的Rep蛋白。Huang等分析了重组表达的Rep蛋白的功能,发现融合状态的Rep蛋白具有ATP酶和GTP酶活性,能够水解脱氧核糖核酸和核糖核酸,其水解效率受环境中镁离子和钙离子的影响,酶活性最佳温度是56℃,最适pH值均为7.5[15]。

6 PBFDV基因型多样性及与宿主的相互关系

伴随着鹦鹉喙羽症在世界范围内的传播和流行,病毒的突变和重组也从未间断,而鸟类贸易的国际化和高密度人工圈养在PBFDV的演化过程中功不可没[19-20]。不同地区间鸟类的自由贸易加速了区域性PBFDV基因型的多样性变化[28]。而单就PBFDV各基因的演化来说,病毒Rep蛋白基因的变异及演化速度远远低于Cap蛋白基因的演化速度。Rep蛋白基因相对具有更高的保守性,这对于PBFDV基因变异分析和病毒起源追溯有着十分重要的意义[8]。

PBFDV基因组为单链环状DNA,像大多数小的单链DNA病毒及RNA病毒一样,保持着高频率的基因变异与重组及在新环境下的快速变异,加之对于鹦鹉种群特异性的感染性及高致死率,常常被用作研究病原与杂交宿主相互关系的模式病毒。宿主基因组中内在的病毒元件为揭示更为久远的宿主与病毒之间的关系提供了线索。Shubhagata Das通过深度分析青绿色小鹦鹉群中圆环病毒的演化与寄生宿主之间的关系发现,圆环病毒的演化远远滞后于病毒宿主的交替更迭[29]。科学家通过对澳大利亚深红玫瑰鹦鹉群长达8年的PBFDV自然感染情况调查发现,鹦鹉父母代亚种和他们的杂交后代在PBFDV流行及载量上存在显著差异,第1次从宿主-病原角度揭示了与迈尔的环物种假说类似的基因组的变异模式。研究揭示了鹦鹉亚种与杂交代在面对病毒感染或者感染压力时功能性宿主反应的差异、宿主杂交代与渐变群在改变宿主-病原相互作用及动力学方面的作用,为病原适应不同宿主群的机制研究提供了思路[30]。杂交后代通常对PBFDV具有更强的抵抗力,也就是说,宿主的基因型从一定程度上决定了其对PBFDV的易感性[9]。而Subir Sarker的研究表明,PBFDV能够通过产生多样的基因型变异实现病毒的跨种间传播[18]。

7 展望

近些年来,鹦鹉喙羽症在世界范围内的广泛传播和流行以及它对各地本土鹦鹉种群产生的威胁受到了越来越多的关注,针对PBFD的病原分子学研究及疫苗研制也迅速铺开。然而,目前最大的研究瓶颈依然是PBFDV体外培养系统尚未成功建立,这极大地限制了PBFDV病原分子特征研究及疫苗研制相关动物实验的开展。分子生物学技术的飞速发展尤其是感染性克隆技术的日臻成熟为PBFDV疫苗研制提供了良好的技术平台和无限可能。我国观赏鹦鹉群中PBFDV的感染情况不容乐观,而规范国内鸟类贸易市场,加强圈养鹦鹉PBFDV检测,及时淘汰患病种鸟,监控野生鹦鹉群移动路径,以及对濒危鹦鹉品种实行常规监测是目前应对鹦鹉喙羽症在我国进一步传播并保护鹦鹉种群完整的有效手段。鹦鹉喙羽症防控任重而道远。