炎症相关性结直肠癌小鼠模型建立及血管生成抑制因子1在结直肠癌中的表达

王磊+时军利+李炳庆

[摘要] 目的 探讨炎症相关性结直肠癌小鼠模型的建立，及血管生成抑制因子1（VASH-1）在结直肠癌中的表达。 方法 将雄性小鼠（C57BL/6）30只按体重大小随机分为两组。A组给予氧化偶氮甲烷（AOM）10 mg/kg右侧腹腔注射，后于第1、4、7周给予1.5%～2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）自由饮用7 d，其余时间自由饮清水。B组给予生理盐水0.1 mL/10 g右侧腹腔注射，此后给予清水自由饮用。均在第10周末处死小鼠，查看成瘤情况。免疫组织化学染色法探讨VASH-1在结直肠癌组织中的表达。 结果 造模结束后A组成瘤率为53.33%，病理提示为腺癌，B组成瘤率为0.00%，两组成瘤率比较差异有统计学意义（P < 0.05）。VASH-1在结直肠癌中高表达，在正常结直肠组织中低表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 本方法建立的炎症相关性结直肠癌小鼠模型成瘤率较高。VASH-1在结直肠癌组织中的表达高于正常结直肠组织。

[关键词] 炎症性肠病；结直肠肿瘤；动物模型；血管生成抑制因子

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the establishment of mice model of inflammation-associated colorectal cancer and expression of vasohibin-1 （VASH-1） in colorectal cancer. Methods Thirty male mice （C57BL/6） were randomly divided into two groups according to the body weight. Group A was given right intraperitoneal administration of azoxymethane （AOM） 10 mg/kg first， and free drink of 1.5%-2.5% dextran sulfate sodium （DSS） at the first， fourth， seventh week later for 7 d， which drunk distilled water on the other time. Group B was given right intraperitoneal administration of normal saline 0.1 mL/10 g， then the mice were given distilled water on the other time. The mice of both groups were killed at the end of tenth week to observe the conditions of tumor formation. The immunohistochemical staining was performed to evaluate the expression of VASH-1 in the of tissue colorectal cancer. Results After modeling， the tumor formation rate of group A was 53.33%， with the pathologic findings of adenocarcinoma， which of group B was 0.00%， the difference was statistically significant （P < 0.05）. VASH-1 had high expression in the colorectal cancer and low expression in normal colorectal tissues， with significant difference （P < 0.05）. Conclusion The tumor formation rate of mice model of inflammation-associated colorectal cancer induced by this method is high. The expression of VASH-1 in colorectal cancer is higher than that in normal colorectal tissues.

[Key words] Inflammatory bowel disease； Colorectal cancer； Animal model； Vasohibin

結直肠癌是常见的恶性肿瘤，结直肠癌的发生与多种因素有关，包括遗传[1]、生活习惯及高脂饮食等原因[2]，此外炎症性肠病是引起结直肠癌的另一类原因[3]。结直肠癌的动物模型可模拟结直肠癌的多种生物学特征，是研究结直肠癌发病机制及治疗的重要手段。炎症性肠病引起的结直肠癌常用的动物模型造模方法为氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）腹腔注射，之后自由饮用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）溶液[4]，文献报道的关于自由饮用DSS的浓度及造模时间多种多样，但应用有效的DSS及缩短造模时间仍在进一步研究中。肿瘤的生长及转移需要依赖肿瘤血管的生成。有些抗肿瘤药物通过抑制肿瘤血管的生成来抑制肿瘤的生长及转移，而在肿瘤血管生成中血管生成抑制因子1（vasohibin-1，VASH-1）是血管生成抑制因子中的一种。本研究探讨炎症相关性结直肠癌小鼠模型的建立及VASH-1在炎症相关性结直肠癌小鼠中的表达情况，或许可以找到抗肿瘤治疗的新靶点。endprint

1 对象与方法

1.1 实验动物

5～6周龄雄性C57BL/6小鼠[购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001]30只。

1.2 主要仪器与试剂

AOM购于Sigma公司，DSS购于MPBio公司，VASH-1购于SANTA公司，DAB试剂盒及生物素-链霉卵白素免疫组化试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验分组及处理

小鼠饲养1周后按体重大小随机分为两组。A组：第1天给予AOM 10 mg/kg右侧腹腔注射，同时给予2.5% DSS自由饮用4 d，清洗水瓶后给予新配制的2.5% DSS自由饮用3 d，清洗水瓶后给予清水自由饮用2周，第4周给予1.5% DSS自由饮用4 d，清洗水瓶后给予新配制的1.5% DSS自由饮用3 d，清洗水瓶后给予清水自由饮水2周，第7周重复第4周的步骤，第8周以后给予清水自由饮用，第10周末处死小鼠。B组：第1天给予生理盐水0.1 mL/10 g右侧腹腔注射，此后给予清水自由饮用，第10周末处死小鼠。实验过程已通过承德医学院附属医院动物伦理委员会论证。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 成瘤率 两组小鼠从直肠至回盲部完整留取结直肠组织，沿长轴切开结直肠，生理盐水反复冲洗，计数肿瘤个数，采用意向性分析原则计算成瘤率，实验中死亡小鼠计为未成瘤。

1.4.2 HE染色 两组小鼠结直肠组织标本均甲醛固定48 h以后进行石蜡包埋，切片后进行HE染色。

1.4.3 免疫组化 免疫组织化学染色方法（SP法）判定VASH-1在结直肠癌组织及正常组织中的表达情况。VASH-1抗体浓度采用1∶300，同时PBS作空白对照。每个标本照取图片（400×）。按细胞阳性率及着色强度分别记分，细胞阳性率记分：着色阳性细胞占图片内细胞比例≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分；着色强度记分：不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。总分=细胞阳性率记分×着色强度记分。总分≤0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为阳性，9～12分为强阳性。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0处理数据。计数资料采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

给药前A组小鼠体重为（18.707±0.976）g，B组为（18.147±1.448）g，两组体重比较差异无统计学意义（P > 0.05）。腹腔注射药物当时B组死亡1只，第1周的第4天A组小鼠逐渐出现便血情况，第6天A组死亡1只，第7天A组死亡2只，解剖后观察肠腔内可见残留血液。第8周A组死亡1只，B组死亡2只，解剖后结直肠内未见肿瘤及出血。

2.2 造模成瘤情况

A组8只小鼠可见肿瘤生长，成瘤率为53.33%，病理提示为腺癌，见图1。B组未见肿瘤生长，成瘤率为0.00%，两组成瘤率比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 VASH-1表达情况

VASH-1在结直肠癌组织中高表达，在正常结直肠组织中低表达，见图2（封三）。A组中阳性表达9只，强阳性表达2只，阴性表达及弱阳性表达0只，阳性表达率为100%。B组中阴性表达9只，弱阳性表达2只，阳性表达1只，阳性表达率为25%。两组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

结直肠癌是常见的恶性肿瘤，其发生部位常见于直肠，其次是乙状结直肠，结直肠癌的发生与多种因素有关，比如遗传、高脂肪饮食、炎症性肠病等。炎症性肠病在亚洲发病率成上升趋势，那么由此导致的结直肠癌就不容忽视，而动物实验是研究炎症相关性结直肠癌的常用方法。关于炎症性肠病导致结直肠癌的动物研究模型常用AOM+DSS来造模，其造模成功率较高[5]。AOM是致癌物，可导致远端结直肠肿瘤，DSS可以诱导结直肠炎症，从而加速肿瘤的形成，用AOM+DSS来进行结直肠癌动物模型建立能反映炎症性肠病相关性的结直肠癌情况[6]。

基于导致结直肠癌发生的原因有很多，已有大量文章報道了多种基因与结直肠癌发生有关，一些基因敲除后可导致或抑制结直肠癌的发生，包括APC、IL-10、Myd88[7-9]、TLR4[10]等。本研究观察炎症相关性结直肠癌模型的建立，为剔除上述原因干扰，我们应用了C57BL/6野生型小鼠为实验对象。同时也已有文献[11]报道了在AOM/DSS诱导小鼠炎症相关性结直肠癌的模型中，雌激素可促进结直肠癌的形成，所以在本研究中仅应用雄性小鼠造模来剔除雌性激素的干扰。Day等[12]报道了高脂肪饮食导致的结直肠癌可能由炎症介导，本研究中小鼠的食物剔除高脂肪作用。

本研究采用了AOM和DSS来建立结直肠癌模型，AOM腹腔注射1次，此后行3个周期的1.5%～2.5%DSS口服，为自由饮用，造模时间为10周，达到的成瘤率为53.33%，瘤体大小中等，完全能够达到实验所用标本数量的要求，也有学者[6]报道了应用AOM腹腔注射1次，此后进行1个周期的DSS自由饮用，造模时间为120 d，然而DSS引起结直肠炎症是急性炎症，停止口服DSS后结直肠炎症逐渐消失，这不符合炎症性肠病慢性炎症的特征，所以本研究应用3个DSS口服周期来模拟炎症性肠病的慢性炎症。结直肠癌的形成与DSS剂量呈正相关[13]，但大剂量的DSS会导致结直肠严重炎症，最终导致小鼠死亡。本研究中第1个DSS循环中第4天小鼠即出现便血，DSS诱导结直肠炎症成功，但此后3 d内A组小鼠死亡3只，解剖后发现肠道内血液滞留，考虑死亡原因为消化道出血，不能除外DSS应用剂量过大引起，遂在此后两个循环中采用1.5% DSS喂养，小鼠仍有便血，但死亡率减少，然而在10周末成瘤率却很高。endprint

肿瘤的发生是源于局部的抑制肿瘤生成因子及促进肿瘤生成因子平衡被打破，但这些因子与脉管系统无直接关系，然而新生血管的生成在肿瘤形成及发展中起至关重要的作用，目前越来越多的研究关注于肿瘤血管的形成，并深入到分子学机制。VASH-1是一个受VEGF-A负反馈调节的血管生成抑制因子，能够抑制血管内皮细胞增殖，促进凋亡，抑制病理性血管生成[14-15]。然而在肿瘤环境中，其抑制血管生成作用却被抑制了[16]。本研究指出在肿瘤组织中VASH-1高表达，在正常结直肠组织中低表达，两者表达情况存在着统计学差异，这表明了VASH-1基因在炎症相关性结直肠癌发生、发展中起着重要作用，但具体机制仍需进一步研究。

有研究表明VASH-1的表达在组织学恶性程度越高、存在转移的肿瘤中表达越高，在结直肠癌[17]、肾癌[18]、头颈鳞状细胞癌[19]、卵巢癌中[20]与肿瘤预后呈负相关，这表明了VASH-1可作为肿瘤血管新生的肿瘤标志物，同时可预测预后。在本研究中因AOM-DSS造模炎症相关结直肠癌模型中，肿瘤均为原位癌，无法证实这种差异，但也一定程度上说明了VASH-1可以作为一种肿瘤标志物来预测肿瘤及预后。临床上，在对肿瘤的治疗中，从肿瘤血管层面治疗的有原发性肝癌、行肝动脉栓塞、化疗等，在分子学层面上有索拉菲尼抑制肿瘤血管生成，针对肿瘤的治疗，在血管层面上的治疗方案能达到预期的结果，而VASH-1在肿瘤中表达的差异，或许为肿瘤分子层面的治疗提供了新的靶点。

本研究采用AOM+DSS来进行炎症相关性结直肠癌模型建立成功，成瘤率达到53.33%，同时造模周期为10周，缩短了造模时间。VASH-1可作為肿瘤预测因子用于临床，同时或许为肿瘤分子层面的治疗提供了新的靶点。

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（收稿日期：2017-08-17 本文編辑：张瑜杰）endprint