辛伐他汀在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中的早期干预作用

杨凯　郭璐　刘跃建

[摘要] 目的 探討早期给予辛伐他汀干预对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠模型的影响及机制。 方法 将42只大鼠（Wistar，清洁级）随机分为空白组、模型组和他汀组，每组14只。采用烟熏加气道内滴入脂多糖法复制COPD大鼠模型，他汀组在造模2周后加用辛伐他汀（5 mg/kg）灌胃治疗。观察大鼠一般表现；监测体重变化；采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法测定血清及支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平；血球计数仪计数BALF中白细胞计数；免疫组织化学染色法测定肺组织中基质金属蛋白酶（MMP-9）的表达；图像分析系统分析各组大鼠病理改变。 结果 模型组及他汀组大鼠体重较空白组减轻（P < 0.01）。血清和BALF中IL-6、TNF-α水平，模型组及他汀组较空白组增加（P < 0.05），他汀组较模型组降低（P < 0.05）。肺组织中MMP-9表达，模型组较空白组增高（P < 0.01），他汀组较模型组降低（P < 0.05）。模型组及他汀组大鼠肺组织符合COPD病理学改变，他汀组组织损伤、重塑及炎症浸润程度较模型组降低。 结论 香烟吸入联合呼吸系统感染可加重肺部及全身炎性反应程度，增加蛋白酶过度表达，参与COPD的发生发展。早期给予辛伐他汀治疗，可在一定程度上减轻肺组织损伤及重塑，降低炎性反应程度，缓解蛋白酶系统亢进。

[关键词] 他汀；慢性阻塞性肺疾病；大鼠；基质金属蛋白酶9

[中图分类号] R563.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（a）-0008-05

[Abstract] Objective To explore the effects of early stage administration of Simvastatin on chronic obstructive pulmonary disease （COPD） rat model and its mechanism. Methods 42 SPF Wistar rats were randomly divided into three groups （n=14）： blank group， model group and Simvastatin group. COPD rat models were replicated with the method of inhaling cigarette smoke and intratracheal instillation of LPS. Simvastatin group rats were gave lavage treatment with Simvastatin （5 mg/kg） after 2 weeks when COPD model was established. Usual manifestations and body weights of rats from the three groups were monitored. The levels of IL-6 and TNF-α in serum and BALF were measured by double antibody sandwich enzyme-linked immuno sorbent assay （ELISA）. Leukocyte in BALF was counted by haemocytometer. The expression of MMP-9 in the lung tissues was measured by immunohistochemically. Pathological examination of lung tissues from every group was analyzed by image analysis system. Results Body weights of rats from the model group and Simvastatin group were significantly reduced compared with those of the blank group （P < 0.01）. Levels of IL-6 and TNF-α in serum and BLAF were higher in the model group and Simvastatin group than the blank group （P < 0.05）. Compared with model group， the levels in Simvastatin group were decreased （P < 0.05）. The expression of MMP-9 in lung tissues， model group was increased than the blank group （P < 0.05）， Simvastatin group was lower than the model group （P < 0.05）. The pathologic characteristics of COPD was observed in the lung tissues from Sim？鄄vastatin group and model group. Copmared with the model group， lung tissue injury， remodeling and inflammatory infiltration in Simvastation group was attenuated. Conclusion Cigarettes inhalation combined with respiratory infections can aggravate pulmonary and systemic inflammation， and up-regulate the expression of proteases， all of which are involved in the genesis and development of COPD. Simvastatin therapy as an early intervention can alleviate the lung tissue injury and remodeling to a certain degree， attenuate pulmonary and systemic inflammation and alleviate the over-activation of proteasesystem.endprint

[Key words] Statin； COPD； Rat； MMP-9

慢性阻塞性肺疾病是一种常见的以持续性呼吸道症状和气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病[1]，气流受限呈进行性发展，与肺部对有害气体或颗粒的异常慢性炎性反应相关。因其发病率、致残率和死亡率高而严重危害着人类的身体健康，给社会和家庭带来了沉重的医疗、经济负担。

世界卫生组织预测，至2020年，COPD将位居世界死亡原因第三位、疾病经济负担第五位。COPD起病隐匿，一旦出现临床症状，往往预示着患者生活质量、呼吸功能以及整体健康水平将逐渐进行性下降，其急性加重更可直接导致患者死亡，因此在疾病早期给予积极有效的治疗显得尤为重要。但目前仍无药物能有效改善患者病程进展、肺功能恶化速率以及居高不下的死亡率。他汀类药物独立于降脂以外的多效性近年来日益获得重视，其通过抑制胆固醇合成途径中间产物（甲羟戊酸、异戊二烯、牻牛儿焦磷酸等）的生成，具有抗炎、抗蛋白酶等多重功效。多项研究表明，他汀类药物能延缓COPD患者肺功能下降速度，降低急性加重频率、住院次数及死亡率[2-3]。

1 对象与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠42只，180～200 g，全雄，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证：11400？鄄700052997，生产许可证：SCXK（京）2012-0001。

1.2 实验试剂

香烟：娇子（时代阳光）牌，川渝中烟工业公司，焦油10 mg，烟气一氧化碳12 mg，烟气烟碱量0.8 mg；脂多糖（LPS）：SIGMA公司，10 mg/支；辛伐他汀片：默沙东制药有限公司，规格：40 mg；大鼠TNF-α酶聯免疫吸附法（ELISA）试剂盒96T，南京建成赛浩科技有限公司；大鼠IL-6 ELISA试剂盒96T，南京建成赛浩科技有限公司；基质金属蛋白酶9（MMP-9）抗体，兔多克隆抗体，英国Abcam公司。

1.3 实验方法

1.3.1 疾病动物模型建立 根据计算机随机数字表法将42只大鼠分为空白组、模型组、他汀组，每组各14只。模型组：第1、14天经耳镜向大鼠气道内滴入200 μg的LPS。余每日置于自制有机玻璃密闭熏烟箱（80 cm×60 cm×50 cm）中被动吸烟（第2～13天、第15～60天）熏香烟2次，每次点燃香烟14支，持续时间1 h，间隔时间4 h，共计烟熏58 d。他汀组：在模型组基础上，于第15天开始，加以辛伐他汀（5 mg/kg）灌胃，再烟熏，余操作同模型组。

1.3.2 体重检测 每周一、四清晨空腹、造模前将大鼠置于电子天平称上进行体重秤量各1次，并记录。

1.3.3 血清中IL-6、TNF-α水平测定 实验第60 d，称重所有大鼠，10 mg/mL戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，分离腹主动脉，抽取动脉血5 mL，于2000 r/min离心10 min，分离血清，采用ELISA法测定血清中IL-6、TNF-α的水平，具体操作按说明书。

1.3.4 支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-6、TNF-α水平测定 切开暴露胸部，结扎右主支气管，于隆突上用套管针穿刺至左肺，以2 mL生理盐水灌洗，缓慢回抽，每次回收约1.5 mL，反复灌洗3次，回收率要求约75%。BALF液4℃，1000 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA法测定BALF中IL-6、TNF-α的水平，具体操作按说明书。

1.3.5 肺组织中MMP-9的表达测定 取右肺下叶，PBS缓冲液冲洗，留取左肺门1 mm×1 cm×1 cm大小组织块，4%多聚甲醛固定，行免疫组织化学染色，测定各组大鼠肺组织中MMP-9的表达。

1.3.6 各组大鼠肺泡计数及肺组织病理生理改变 取新鲜右肺上叶组织约1 cm×1 cm×1 cm，放入4%多聚甲醛中固定，行HE染色，光镜下观察各组大鼠单位面积下肺泡计数及肺组织病理生理改变。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验共纳入42只大鼠，每组14只。烟熏2周后，模型组及他汀组大鼠早期表现为烦躁、好动、激惹，后期表现为精神萎靡、反应迟缓、懒动，进食减少、多饮，毛发杂乱、潮湿、枯黄、无光泽。空白组反应灵敏，精神、饮食正常，毛发色白、光滑、柔顺、有光泽。

在烟熏至1个月时，模型组和他汀组各处死2只大鼠，取肺组织经HE染色后观察COPD模型复制效果，可见气管支气管周围炎症细胞浸润，部分纤毛倒伏，但尚未见明显肺泡腔肺泡壁破坏及肺大泡肺气肿形成。

2.2实验前及实验结束时各组大鼠体重改变

实验开始前，各组大鼠间体重差异无统计学意义（P > 0.05）。实验结束时，模型组合和他汀组较空白组体重降低（P < 0.05），他汀组体重较模型组略有增加，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠BALF中IL-6、TNF-α水平差异

BALF中IL-6、TNF-α水平，模型组、他汀组较空白组表达增加（P < 0.05），他汀组较模型组降低（P < 0.05）。见表2。

2.4 各组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平差异

血清中IL-6、TNF-α水平，模型组、他汀组较空白组水平增高（P < 0.05），他汀组较模型组减少（P < 0.05）。见表2。

2.5 各组肺组织中MMP-9的表达endprint

经图像分析软件测得各组MMP-9平均分光密度，模型组较空白组表达增高（P < 0.05），他汀组较模型组表达降低（P < 0.05），他汀组与空白组差异无统计学意义（P > 0.05），见表2。图1中棕黄色为MMP-9蛋白的阳性表达。

2.6 各组光镜下单位面积下肺泡计数

光镜下平均每个视野肺泡数量比较，模型组和他汀组较空白组减少（P < 0.05），他汀组较模型组肺泡计数有所增加（P < 0.05），见表2、图2。

2.7 肺组织病理改变

模型组大鼠可见各级气管、支气管内纤毛粘连、倒伏、脱落，杯状细胞增生，平滑肌增生、肥厚，慢性炎症改变伴大量炎症细胞浸润；肺泡壁变薄、扩张、破裂、融合，肺大泡及肺气肿形成，肺泡间隔增厚；细支气管伴行肺小动脉内膜增厚，中膜平滑肌增生，管腔狭窄、闭塞，肺毛细血管数目减少。他汀组纤毛脱落较模型组减少，炎症浸润及平滑肌增生减轻；肺泡破裂融合减少，肺泡间隔增厚略缓解；肺小动脉炎减轻，毛细血管管腔闭塞及数目减少略缓解，见图2。

3 讨论

慢性炎性反应是COPD的主要致病机制之一，这种炎性反应持续存在并呈进行性恶化[4]。IL-6、TNF-α及白细胞作为临床常用的炎性反应标志物，在COPD患者体内明显增高，并能较好的反映患者炎性反应程度[5-6]。

COPD大鼠体内存在明显的炎性反应，多种炎症标志物水平较空白组中显著升高，早期给予辛伐他汀治疗后，可以改善这一炎性反应程度，降低白细胞计数、TNF-α、IL-6等炎症标志物水平，具有明显的抗炎功效。其抗炎机制可能为[7]：胆固醇合成途径中间产物（甲羟戊酸、异戊二烯、牻牛儿焦磷酸等）是多种蛋白表达、酶类活化、细胞构成的重要组成部分，对维持细胞骨架稳定性、细胞膜流动性及线粒体功能有着重要作用；并能调控细胞增殖和凋亡。辛伐他汀通过抑制胆固醇合成中间产物的生成，在表达、修饰和降解等多个层面降低TNF-α、IL-6和白细胞计数等炎症标志物水平，以此来减轻炎性反应，调节体内稳态，使气道、肺部的慢性炎症得到改善[8-9]。

蛋白酶可消化弹性蛋白及肺泡壁上的多种蛋白结构，其中基质金属蛋白酶（MMPs）为主要成分之一，在COPD的发生发展过程中有着重要作用。MMP-9作用底物广泛，能降解肺实质细胞外多种基质成分[10]；能促进炎性反应和组织损伤，参与了COPD患者肺组织和血管的损伤、重塑过程，是评估患者体内蛋白酶系統亢进的主要生物标志物之一[11]。张立海等[12]研究证明辛伐他汀可以降低COPD肺大鼠MMP-9及其抑制剂的表达水平。COPD大鼠体内蛋白酶系统亢进，肺组织中MMP-9的表达明显增高。本实验显示COPD大鼠早期给予辛伐他汀治疗后，也可降低肺组织中MMP-9的表达，改善蛋白酶系统亢进，平衡蛋白酶-抗蛋白酶系统。

其抗蛋白酶机制可能与辛伐他汀阻断甲羟戊酸、牛儿基焦磷酸的生成[13]，抑制多种信号通道（RhoA/ROCK、Ras等）的活化及异戊烯化[14]，减少MMP-9的mRNA表达和释放相关[15]。早期给予辛伐他汀治疗，可降低COPD大鼠炎性反应程度，改善蛋白酶系统亢进，一定程度上改善肺组织损伤和重塑[16]，延缓COPD病程进展、改善远期预后，与国内外多项研究结果一致[17-18]。

但近期国外研究结果显示[19]，在肺功能中重度受损的患者人群中，辛伐他汀并不能降低其急性加重频率[（1.36次/（人·年）：1.39次/（人·年），P=0.54）]、首次急性加重时间（223 d：231 d，P = 0.34）以及病死率[（30/430）：（28/447），P = 0.89]，与本实验结果并不相符。其结果的差异原因可能为，该研究纳入标准是基于COPD诊断确立，肺功能呈中重度受损后再给予辛伐他汀治疗，考虑此时严重的病理结构改变已近不可逆转，同时伴有严重的整体健康状态的恶化，再给予他汀类药物治疗，才导致其疗效甚微甚至无效。

本实验在疾病早期（烟熏2周）即给予辛伐他汀治疗，才能获得降低炎性反应、缓解蛋白酶系统亢进、改善其肺组织损伤和重塑等功效。辛伐他汀可能在COPD早期患者人群中的获益更为明显，可提高其生活质量，改善病程进展及远期预后[20]。为COPD提供了新的治疗思路，同时对COPD早期诊断有了更多的期望，再一次的阐述了早诊断、早治疗的重要性。

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（收稿日期：2017-08-22 本文编辑：任 念）endprint