Tubacin对慢性不可预见性温和应激模型大鼠的抗抑郁作用及其作用机制研究

孙国平　李昆　卢豪忠

[摘要] 目的 探討组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）选择性抑制剂tubacin对慢性不可预见性温和应激（CUMS）模型大鼠的抗抑郁作用及其可能的作用机制。 方法 将50只成年雄性SD大鼠随机分为五组（n = 10）：对照组（A组），CUMS模型组（B组），氟西汀处理组（C组），tubacin处理组（D组），氟西汀联合tubacin处理组（E组）。应用Morris水迷宫定位航行试验及空间探索试验测试大鼠的空间学习、记忆情况。采用还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒检测各组大鼠血清中GSH水平。 结果 Morris水迷宫定位航行试验显示，与A组比较，B组大鼠平均逃避潜伏期显著延长（P < 0.05或P < 0.01）；与B组比较，C、D、E组平均逃避潜伏期明显缩短（P < 0.05或P < 0.01），且E组平均逃避潜伏期显著短于C组和D组（P < 0.05或P < 0.01）。在空间探索试验中，C、D、E组大鼠在第三象限的停留时间明显长于其他三个象限（P < 0.05或P < 0.01），E组大鼠在第三象限的停留时间明显长于C组和D组（P < 0.05或P < 0.01）。B组大鼠血清GSH水平明显低于A组（P < 0.05），C组血清GSH水平显著高于B组（P < 0.05），E组血清GSH水平较C组进一步提高（P < 0.05），并且与A组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。相关性分析发现，大鼠的空间学习、记忆能力与血清GSH水平显著相关（P < 0.05）。 结论 HDAC6选择性抑制剂tubacin可通过调节血清GSH水平以提高大鼠空间学习和记忆能力，从而发挥抗抑郁作用。

[关键词] 抑郁症；组蛋白去乙酰化酶；Tubacin；还原型谷胱甘肽；慢性不可预见性温和应激

[中图分类号] R749.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（a）-0013-05

[Abstract] Objective To investigate the antidepressant effects of histone deacetylase 6 （HDAC6） selective inhibitor tubacin for the model rats with chronic unpredictable mild stress （CUMS） and its mechanism. Methods Fifty male adult rats were randomly divided into 5 groups （n = 10）： control group （group A）， CUMS model group （group B）， Fluoxetine treatment group （group C）， tubacin treatment group （group D） and combination of Fluoxetine and tubacin treatment group （group E）. The spatial learning and memory abilities of rats were tested by orientation navigation experiment and spatial probe trial of Morris water maze. Meanwhile， the levels of serum reduced glutathione （GSH） in all groups were measured by GSH kits. Results The orientation navigation experiment of Morris water maze showed that compared with group A， the mean escape latency of rats in group B was significantly lengthened （P < 0.05 or P < 0.01）， compared with group B， the mean escape latency of rats in group C， D， E was significantly shortened （P < 0.05 or P < 0.01）， and the mean escape latency of rats in group E was significantly shorter than those of group C， D （P < 0.05 or P < 0.01）. In the spatial probe trial， the length of stay in the third quadrant of group C， D， E was significantly longer than those of the left three quadrants （P < 0.05 or P < 0.01）， the length of stay in the third quadrant of group E was significantly longer than those of group C， D （P < 0.01， P < 0.05）. The level of serum GSH in group B was significantly lower than that of group A （P < 0.05）， while the level of serum GSH in group C was significantly higher than that of group B （P < 0.05）， the level of serum GSH in group E was significantly higher than that of group C （P < 0.05）， there was no statistically significant difference between group E and group A （P > 0.05）. Correlation analysis showed that the spatial learning and memory abilities of rats were significantly correlated with the level of GSH （P < 0.05）. Conclusion HDAC6 selective inhibitor tubacin can improve the spatial learning and memory abilities of rats by regulating the levels of GSH， so as to play antidepressant effects.endprint

[Key words] Depression； Histone deacetylase； Tubacin； Reduced glutathione； Chronic unpredictable mild stress

近年来抑郁症的发病率不断上升，引起的社会问题日益严重[1]。药物治疗是目前治疗抑郁症的主要手段[2-3]。尽管现有抗抑郁药物众多，但均存在起效慢、复发率高等缺陷，而且临床上存在大量的患者对抗抑郁药治疗反应不佳[4-6]。一项大样本回顾性研究发现，75%～80%的抑郁症患者在抗抑郁治疗过程中存在复发现象[7]。因此寻找新的有效药物成为抗抑郁治疗中亟需解决的问题。

表观遗传调控研究的深入为抗抑郁治疗开辟了新道路，有望成为解决上述问题的突破口。组蛋白的乙酰化修饰是表观遗传调控的重要方式，有研究表明，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）在抗抑郁治疗中起着重要作用[8-9]。组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）是HDACs家族的一员，研究证实，HDAC6在精神类疾病的发生、发展过程中发挥重要作用，并且抑郁症患者血清中也存在HDAC6表达上调现象[10]。后续研究发现，HDAC6选择性抑制剂tubacin（tubulin acetylation inducer）能够通过调控还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）水平发挥显著的抗精神分裂及抗神经退行性疾病作用[11-12]。然而，tubacin能否产生抗抑郁作用尚无报道。因此，本研究采用慢性不可预见性温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠，研究tubacin对慢性应激大鼠空间学习、记忆及血清GSH水平的影响，旨在明确tubacin的抗抑郁作用以及其产生抗抑郁作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物

成年雄性SD大鼠，（200±20）g，7～9周龄，清洁级。由上海交通大学医学院试验动物中心提供（合格证号：中科动管第003号）。

1.2 试剂

氟西汀及tubacin购于美国Sigma公司，GSH检测試剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 试验动物分组及给药 将健康雄性SD大鼠随机分为五组（n = 10）：对照组（A组，给予生理盐水灌胃），CUMS模型组（B组，采用不同应激因子交替刺激加孤养复制CUMS模型，并给予生理盐水灌胃），氟西汀处理组（C组，采用不同应激因子交替刺激加孤养复制CUMS模型，并给予氟西汀灌胃），tubacin处理组（D组，采用不同应激因子交替刺激加孤养复制CUMS模型，并给予tubacin灌胃），氟西汀联合tubacin处理组（E组，采用不同应激因子交替刺激加孤养复制CUMS模型，并给予氟西汀+tubacin灌胃），应激前10 min，灌胃给药，共4周。氟西汀的用药剂量为10 mg/kg，tubacin用药剂量为3 mg/kg，溶剂为生理盐水。

1.3.2 CUMS抑郁模型的建立 正常对照组每笼5只饲养，正常饮水进食，不给予任何刺激。其余各组采用CUMS结合孤养方法建立大鼠抑郁模型。CUMS包含以下7种不同的刺激因子：①禁食24 h；②禁水24 h；③高速水平震荡5 min；④昼夜颠倒；⑤4℃冷刺激5 min；⑥45℃热刺激5 min；⑦夹尾5 min，每日随机给予一种应激刺激，相同刺激不连续出现。

1.3.3 空间学习、记忆能力观察 大鼠的空间学习、记忆能力将利用Morris水迷宫试验进行测定，造模结束后，进行空间搜索试验及定位航行试验两个部分。水迷宫水池被均等划分为4个象限，并将第三象限划分为目标象限。①定位航行试验：首先将大鼠置于水迷宫平台上进行适应20 s，随后，随机将大鼠从除目标象限外的其他不同象限置入水池，直到大鼠爬上平台后终止记录，如若120 s内大鼠依旧无法上台，则人为引导其爬上平台适应10 s，最后，将大鼠烘干放入鼠笼。定位航行训练共计5 d。记录大鼠平均上台（逃避）潜伏期，以评判其空间学习能力。②空间探索试验：在定位航行试验结束1 d后撤除水池中的平台，随后，将大鼠从除目标象限外的其他不同象限置入水池，大鼠在120 s内的游泳轨迹将被记录，用以测量大鼠在目标象限的游泳时间，以评估其记忆能力。

1.3.4 血清GSH水平的检测 各组大鼠在最后1次给药24 h后从内眦采取静脉血，离心分离出血清，保存于-80℃冰箱待测。血清中GSH的含量检测将严格按照检测试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法

使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，相关性分析采用Pearson相关检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠在定位航行试验中的平均逃避潜伏期

随着CUMS造模试验的推进及水迷宫试验次数的增多，各组大鼠的平均潜伏期呈现递减的趋势。其中，与A组比较，B组大鼠平均逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），提示CUMS模型对大鼠学习、记忆能力产生了较明显的损害；与B组比较，C、D组大鼠平均逃避潜伏期显著缩短，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），提示tubacin改善了CUMS模型鼠的学习、记忆能力；与C、D组比较，E组大鼠逃避潜伏期进一步减少，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），提示tubacin与氟西汀联用对改善抑郁模型鼠的学习记忆能力起协同作用。见图1。

2.2 大鼠在空间探索试验中各象限停留的时间

空间探索试验结果显示，B组大鼠水迷宫第三象限停留时间显著短于A组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），见图2A；C、D、E三组大鼠在第三象限的停留时间明显长于其他3个象限（P < 0.05或P < 0.01），见图2B～D，提示CUMS造模损伤了大鼠的空间记忆能力，并破坏其空间定位准确性，给药tubacin或氟西汀后，应激组大鼠空间记忆的保持能力有较好的恢复；且E组大鼠在第三象限停留时间明显长于C、D组（P < 0.01、P < 0.05），提示tubacin与氟西汀合用对大鼠空间记忆力的恢复作用强于单用tubacin或氟西汀，见图2E。endprint

2.3 各組大鼠血清GSH水平比较

B组血清GSH水平显著低于A组（P < 0.05），提示抑郁症大鼠血清存在GSH水平下调现象，C组血清GSH水平较B组明显上调，差异有统计学意义（P < 0.05）。D组血清GSH水平与B组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。E组大鼠血清GSH水平较C组进一步升高（P < 0.05），且E组的大鼠血清GSH水平几乎恢复到正常（A组）水平（P > 0.05），提示tubacin可能通过提高血清GSH水平进而发挥其抗抑郁活性，而氟西汀能够加强tubacin的GSH调控能力。见图3。

2.4 抑郁大鼠空间学习、记忆能力与血清GSH水平的相关性

给予抑郁症模型大鼠tubacin和/或氟西汀处理，从行为学观察B组为抑郁模型状态，而C、D、E组抑郁症状明显改善。然而，D组大鼠血清GSH水平与B组比较并未发生明显改变（图3）。因此，把C、E组的水迷宫行为学测试结果和血清GSH水平进行相关性分析，结果显示C、E两组逃避潜伏期、平台象限游泳时间与血清GSH水平具有显著相关性（R2 = 0.8498、0.8846、0.8652、0.8237，均P < 0.05）。见图4。

3 讨论

本研究结果显示，tubacin及氟西汀能够改善抑郁应激模型大鼠空间学习和记忆能力。氟西汀是选择性5-羟色胺（5-HT）回收抑制剂，间接性增加大脑自身的5-HT水平，缓解5-HT缺乏状态，进而对抑郁症的相关症状产生治疗作用[13]。tubacin作为HDAC6选择性抑制剂在本研究中发现其具有显著的抗抑郁作用，但弱于氟西汀[14]。进一步研究证实，tubacin和氟西汀合用能够产生协同抗抑郁作用，国内外文献鲜见此类报道，可以为抑郁症的治疗提供新的思路。

以记忆减退为特征的认知功能损害已成为多数抑郁症患者的主要症状。研究表明，组蛋白的乙酰化修饰作为染色质重塑的方式之一，也参与了记忆的形成，尤其是海马依赖性的记忆[15]。有研究报道，HDAC1和HDAC6与抑郁症记忆、认知关系不大，而HDAC3与记忆、认知具有相关性[16]。HDAC6在抑郁症患者血清中高表达可能是调控了抑郁症的其他症状，如睡眠障碍、情感障碍。本研究发现tubacin的抗抑郁作用与血清GSH水平具有显著相关性，但尚不能证实tubacin是否通过抑制HDAC6表达从而改善抑郁症症状。

GSH是衡量体内氧化应激水平的重要指标。氧化应激与内源性抗氧化物质功能的减退在抑郁症的发生中起着重要的作用[17]。研究发现，心理应激因直接或间接造成机体GSH水平降低及促氧化物酶活性增加而成为抑郁症氧化应激反应的重要原因[18-19]。抑郁症患者血清GSH水平与抑郁症严重程度、自杀倾向强度密切相关[20]。本研究显示，抑郁症模型大鼠血清中GSH水平明显低于对照组，用药氟西汀后并不能显著提高大鼠血清内GSH水平，而tubacin明显提高了抑郁模型大鼠血清中GSH水平。进一步研究发现，氟西汀能够加强tubacin的GSH水平调控作用。研究证实了抑郁症大鼠存在血清GSH水平降低现象，验证了tubacin通过调控GSH水平改善抑郁症状的作用，丰富了抑郁症的机制研究思路。然而，tubacin是通过何种途径调控了体内GSH水平，该调控作用是否与HDAC6表达相关还远未阐明。

综上所述，本研究提示tubacin可通过调控体内GSH水平产生抗抑郁作用，并且，tubacin与氟西汀抗抑郁作用具有协同性，氟西汀能够加强tubacin的GSH水平调控作用。相关性分析发现，血清GSH水平与抑郁症症状显著相关。因缺乏相关的文献报道和试验依据，两药共用产生一系列作用的机制尚不清楚。但是，本研究为抑郁症的药物治疗提供了新的思路，也为抗抑郁症药物开发提供了新的研究方向。

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（收稿日期：2017-07-19 本文編辑：张瑜杰）endprint