甘蓝型油菜蕾薹期抗旱相关性状的QTL分析

黄 倩，赵永国，黄祥伟，朱宗河，刘云清，马海清，程 勇，邹锡玲，徐劲松，张学昆，陆光远

(1.农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室/中国农业科学院油料作物研究所， 湖北 武汉 430062；2.安徽农业大学农学院， 安徽 合肥 230036；3.湖北省浠水县农业局，湖北，浠水，438200)

作物在生长过程中经常遭受到各种生物胁迫和非生物胁迫，其中干旱胁迫是非生物胁迫中对作物生长和产量影响最严重的胁迫之一[1]。油菜是重要的油料作物,我国每年油菜种植面积和总产出约占世界的1/3[2]。干旱直接影响油菜的生长，导致油菜总荚数、每荚粒数、单株种子数及单株产量显著下降[3-4]，严重影响油菜产量。长江流域是我国油菜主产区，虽然降雨充沛，但全年降水分布不均匀，季节性干旱频发[5]，比如2010年发生的西南五省冬、春季特大干旱，2011年长江中游五省的春、夏季特大干旱。有研究发现春旱使中国长江中下游地区的油菜平均减产20%以上[6]。而春旱正值油菜蕾薹期，是生长需水量较大时期，此时发生干旱严重影响油菜的形态建成，造成地上部营养体偏小，进而影响油菜的产量因子的发育和最后产量的形成[7]。因此，对油菜蕾薹期的抗旱性研究更有意义。

近年来在小麦[8]、大豆[9]、玉米[10]等作物中已经开展了较多抗旱相关性状的QTL定位研究，但有关油菜抗旱QTL的研究还鲜见报道。其中王丹丹[11]以F2∶4群体为材料，采用复合区间作图方法，对苗期叶绿素质量分数、叶片相对含水量、叶片保水力、可溶性糖质量分数、丙二醛质量分数5个耐旱相关性状及其耐旱系数进行了QTL分析，共检测到8个QTL。荐红举等[12]通过构建重组自交系高密度SNP遗传图谱，找到8个与抗旱相关的QTL位点。前人研究多以叶片脯氨酸含量、萎蔫指数、植株干重、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、光合速率等作为作物抗旱性状鉴定指标[13-15]。然而，在育种实践中往往需要用到更加简单、直观的形态指标来判断植株的抗旱水平，包括产量、株高及叶片萎蔫指数等。研究这些抗旱相关性状的遗传基础是开展抗旱育种的前提。因此，本研究针对长江流域春旱频发的特点，利用抗旱能力差异较大的两个甘蓝型油菜亲本构建了一个F2∶3群体，对甘蓝型油菜蕾薹期抗旱相关性状进行了初步的QTL定位，估计相应的QTL效应大小，以期为抗旱相关性状分子标记辅助选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究用到的油菜抗旱亲本QY8-1(P1)来源于秦优8号，已经过7代自交、选择，形成纯系。干旱敏感亲本为沪油16号(P2)，也已经自交多代纯合。这两个亲本的抗旱性经过发芽期、苗期及成株期的综合鉴定，差异十分明显[16]。以QY8-1为母本，与沪油16号杂交得到F1，从中选择1株套袋自交得到F2，经进一步培育获得了F2∶3群体，该群体由183个家系组成。

1.2 试验设计

抗旱性鉴定试验于2010年10月到2011年5月在干旱棚中进行。田间试验采用裂区试验设计，主区为水分处理(干旱胁迫和正常供水)，副区为不同基因型。处理内设置3个重复，每小区种植1行，随机区组排列。整地前按1 500 kg·hm-2均匀施俄罗斯复合肥(中化化肥有限公司)，N、P、K的比例为16∶16∶16，播种后不再追肥。10月7日播种两个亲本及 183个F2∶3家系，每份材料播种一行。播种后立即均匀浇水，保证其正常发芽和生长。25 d后进行间苗和定苗，株、行距分别为0.1 m和0.3 m，行长2.4 m。

水分处理方式：利用喷灌设施进行精量分行供水，土壤含水量利用SM-5M土壤湿度传感器进行实时监测，从现蕾期(即小区75%植株剥开主茎顶端1～2片小叶能见到明显花蕾的时期)开始处理，当0～40 cm的土壤层平均含水量降低到15%时认为干旱胁迫开始(约需要3 d)，到抽薹期(即小区75%以上植株主茎伸长且主茎顶端离子叶节达10 cm为止)结束[16]，约持续30 d，干旱胁迫处理结束后立即恢复供水。对照区则充分供水，使0～40 cm的土壤层平均含水量保持在30%以上。田间管理按常规方法进行。

1.3 性状考察

叶片萎蔫指数和植株鲜重的调查在干旱胁迫后30 d进行。首先以小区为单位，中午时分连续观察并记载萎蔫指数。油菜萎蔫指数分为5 级，1级为无萎蔫(赋值为1.00)；2级为轻微萎蔫(<10%植株萎蔫，赋值为0.75)；3级为萎蔫(40%～70%植株萎蔫，赋值为0.50)；4级为明显萎蔫(>90%植株萎蔫，赋值为0.25)；5级为严重萎蔫(叶片黄化、褐化或大部分叶片死亡或脱落，赋值为0.00)。萎蔫指数越小，其抗旱性就越差；反之萎蔫指数越大，则其抗旱性越强。

测完叶片萎蔫指数后，每行连续选取5株，连根拔起，立即用清水除净根部泥土，滤纸吸干，用电子天平测定单株重量，取平均值后即为单株鲜重。抽薹高度在复水后5 d(即干旱胁迫开始后的35 d)调查，分别测量正常灌溉和干旱胁迫条件的单株抽薹高度，每家系选5株，最后计算平均值。各性状的抗旱系数计算方法如下：

抗旱系数=干旱胁迫下的测定值/正常灌溉条件下的测定值。

1.4 DNA的提取

在亲本和F2群体各单株中分别选取2.0 g叶片采用CTAB法[17]提取DNA，用分光光度计测定DNA浓度，调整到50 ng·μL-1后冰箱保存备用。

1.5 SRAP标记分析

SRAP引物由上海生工合成提供[18]。其中上游引物8条(Me01-Me08)，下游引物20条(Em01-Em20)(表1)，一共组成160对引物。PCR反应体系为：10×Taq Buffer(含Mg2+)1 μL、10 mmol·L-1dNTP 0.2 μL、50 ng·μL-1引物0.9 μL、5 U·μL-1Taq DNA多聚酶0.25 μL、50 ng·μL-1DNA模版0.5 μL，加ddH2O至10 μL。反应程序为：95℃变性3 min；94℃变性1 min，35℃复性30 s，72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物在6%变性PAGE凝胶上分进行电泳检测，银染法显色。

1.6 遗传作图和QTL分析

将LOD最小值设为2.0，应用软件MapMaker3.0[19]构建甘蓝型油菜遗传连锁图谱。用Kosambi函数将重组值转换为遗传图距，并进一步用MapDraw软件画出连锁图谱[20]。应用软件WinQTLCart 2.5[21]的复合区间作图法对抗旱相关性状进行QTL定位分析。重复抽样1 000次，取LOD值2.0为QTL存在的阈值，QTL的命名按“性状+处理条件+序号”进行。

2 结果与分析

2.1 亲本及群体的抗旱性表现

在干旱胁迫和正常灌溉条件下，比较了两个亲本P1(QY8-1)、P2(沪油16)及F2∶3群体的抗旱性。由表2所示，甘蓝型油菜三个性状在两亲本之间存在明显差异。与正常灌溉相比，干旱胁迫下P1的抽薹高度下降了21.2%，而P2下降幅度高达59%，是P1的2.8倍。叶片萎蔫指数的对比更明显，在正常条件下P1和P2都在0.98以上，但在干旱条件下P1略有下降(0.80)，而P2则大幅度下降到0.36，仅有前者的45%(0.36/0.80)。同样，在干旱条件下单株鲜重也受到严重影响，P1、P2分别下降了52.5%和64.2%。以上结果表明，干旱对抽薹高度、单株鲜重以及叶片萎蔫指数等性状的影响较大，而且存在基因型差异，其中亲本P1的抗旱性较好，P2的抗旱性较差。

表1 本研究利用的SRAP引物序列

经干旱处理后，由亲本P1和P2构建的F2∶3家系各性状也明显变化(表2)。其中，抽薹高度平均下降了53.6%，单株鲜重平均下降了55.3%，叶片萎蔫指数平均下降了52.6%。在干旱胁迫和正常供水两种环境下，F2∶3家系的各性状值为连续分布表明为多基因控制的数量性状。正态分布检测表明，这些性状分布基本符合正态分布，适合于QTL分析。

表2甘蓝型油菜亲本及群体抗旱相关性状的表现

Table 2 Evaluation of drought related traits in rapeseed parents and population

性状Trait处理Treatment亲本ParentQY8-1沪油16Huyou16F2∶3Family均值Mean最小值Min最大值Max方差Variance偏度Skewness峰度Kurtosis抽薹高度/cmShootheight单株鲜重/(Plant·g-1)Freshweight叶片萎蔫指数Leafwiltingindex灌溉Watered60.4020.0047.1015.4081.60182.400.23-0.41干旱Drought47.608.2021.801.6058.20160.800.73-0.08灌溉Watered275.40244.20270.80240.00299.80155.20-0.18-2.46干旱Drought130.8087.40120.9097.80148.2066.400.10-1.51灌溉Watered0.990.980.970.951.000.00.09-0.97干旱Drought0.800.360.460.100.890.10.18-1.30

叶片萎蔫指数是反映植物抗旱性最直观的指标[22]。相关性分析表明，在干旱胁迫下F2∶3群体的叶片萎蔫指数与抽薹高度及单株鲜重均呈极显著正相关，相关系数分别为0.829**和0.734**；单株鲜重也与抽薹高度呈极显著正相关(r=0.734**)(表3)，由此可见，抽薹高度与单株鲜重也是衡量抗旱性的重要指标，而且这些性状可能受到某些共同的遗传控制。另外，上述性状抗旱系数之间的相关系数更高，均在0.996以上(表3)，进一步说明了这三个性状之间具有密切的关系。

表3 F2∶3群体在干旱胁迫下性状(上三角)及其抗旱系数(下三角)间相关性分析

注：**表示在0.01水平上显著。

Note：** represent statistically significant atP<0.01.

2.2 遗传连锁图谱构建

在油菜亲本P1和P2中共筛选了160对SRAP引物，扩增条带数在5～46之间，多态性片段数量在1～13之间，平均为4.2条。按照多态性标记、多条带清晰的原则，最终选择了75对引物进行群体分析，共得到了388个多态性标记，平均每对引物组合产生5.2个标记。

对群体中检测到的388个标记进行遗传作图，发现共有335个标记可以进入连锁群，剩余的53个标记无法进入连锁群。该遗传图谱包含了21个连锁群，其中LG1包含的标记数目最多，达53个；LG21的标记数目最少，仅有4个。单个连锁群的遗传图距在32.4～238.3 cM之间，整个连锁遗传图谱长度为1661.9 cM，标记间的平均距离为4.96 cM，满足QTL定位标记间距离小于15 cM的要求[23]。

2.3 抗旱相关性状的QTL分析

利用复合区间作图法，在正常灌溉和干旱胁迫下分别对抽薹高度、单株鲜重、叶片萎蔫指数及这些性状的抗旱系数进行QTL分析，一共找到了28个QTL，分布在21个连锁群中的14个连锁群上(图1)，可解释的表现变异在1.1%～36.6%之间不等(表4)。

2.3.1 抽薹高度 共检测到10个QTL位点，分别位于第1、5、9、10、12、15和19连锁群上(图1)。单个QTL的贡献率在4.3%至36.6%之间，其中在干旱胁迫下6个，正常灌溉条件下2个，抗旱系数2个(表4)。qSH-W-1、qSH-W-2、qSH-D-1、qSH-D-3、qSH-DRI-2的加性效应均来自沪油16的增效作用，其它5个QTL的加性效应均来自QY8-1的增效作用。其中，在干旱胁迫下定位到的qSH-D-5位于第15连锁群标，能解释36.6%的表型变异，属于主效QTL。利用抗旱系数检测到的qSH-DRI-1与主效QTLqSH-D-5位于同一连锁群，都位于Em07/Me04-6—Em02/Me20-3区间，但贡献率仅有6.5%。

2.3.2 单株鲜重 共检测到12个QTL位点，分别位于第2、8、11、12、13、16、19连锁群上(图1)。单个QTL的贡献率在1.6%到11.2%之间。其中干旱胁迫下2个，正常灌溉条件下6个，抗旱系数4个(表4)。qFW-DRI-3、qFW-DRI-2、qFW-D-2、qFW-DRI-4的加性效应均来自QY8-1的增效作用，qFW-W-2的加性效应为0，其余的QTL的加性效应为负值。其中qFW-D-2的遗传贡献率最大(R2=8.7%)。正常灌溉下检测到的qFW-W-3与利用抗旱系数检测到的qFW-DRI-2都位于第11连锁群的同一位置，贡献率分别为4.9%和4.0%。

注：白色、红色和蓝色图案分别代表正常供水、干旱处理和抗旱系数Note: White, red, and blue color indicate the watered condition, drought stress, and drought resistant index, respectively

注：q, QTL; SH, 抽薹高度; FW, 单株鲜重; LWI, 叶片萎蔫指数; W, 正常供水; D, 干旱处理; DRI, 抗旱系数。

Note: SH, shoot height; FW, plant fresh weight; LWI, leaf wilting index; W, water supply; D, drought stress; DRI, drought resistant index.

2.3.3 叶片萎蔫指数 共检测到6个QTL位点，分别位于第4、8、15、16连锁群上。单个QTL的遗传贡献率在1.1%到13.5%之间。其中干旱胁迫下检测到2个，正常灌溉条件下3个，抗旱系数1个(表4)。除了qLWI-W-2和qLWI-D-2的加性效应是负值，其它QTL位点的加性效应都是正值，增效位点来源于亲本QY8-1。在干旱胁迫下检测到的qLWI-D-1能解释5.2%的表型变异，位于第15连锁群，相同位置还检测到抗旱系数的QTLqLWI-DRI-1，其贡献率为3.1%。同样，在第16连锁群的标记区间Em01/Me12-1—Em01/Me09-1也检测到两个重叠的QTL(qLWI-W-3和qLWI-D-2)，但贡献率仅有1.1%～4.5%，属于微效QTL。

3 讨 论

在干旱胁迫下，两个亲本的性状差异较明显，例如QY8-1的抽薹高度为47.6 cm，而沪油16的抽薹高度仅有8.2 cm，明显低于前者。另外两个指标(单株鲜重和叶片萎蔫指数)也是如此，说明现蕾至抽薹时期的干旱对油菜的生长和发育产生重要影响，而且不同基因型对干旱胁迫的反应存在差异，其中QY8-1的抗旱性较好，沪油16的抗旱性较差。F2∶3群体中除了在干旱胁迫条件下的单株鲜重以外，其它各性状在不同环境处理下均为超双亲表现，说明两个亲本间既存在增效基因又存在减效基因，通过基因的重新组合有望在群体后代中筛选到抗旱性显著增强的新材料。

国内外有关甘蓝型油菜抗旱相关性状QTL研究报道较少。Li等[24]利用性状差异大的甘蓝型油菜亲本构建了一个DH群体,利用该群体在苗期对株高、根长、地上部干重、根干重及总干重等性状进行了QTL分析，在不同水分胁迫下共定位到51个QTL，其中利用抗旱系数为性状共扫描到19个QTL。本研究利用F2∶3群体在抽薹期共定位到28个抗旱相关QTL，明显少于上述报道。可能原因是两者使用的群体类型不同，检测时期不同，以及测定指标也不尽相同。另外，油菜在不同发育时期的抗旱性及其采用的应对策略也是变化的(陆光远等，未发表)。本研究还发现了许多重叠的QTL(比如LG8、LG11、LG13、LG14、LG15、LG16和LG19上分别可测到2～4个重叠的QTL，见图1)，一方面说明QTL检测结果的可靠性，另一方面也说明部分QTL位点具有一因多效作用，即一个QTL可以同时控制多个性状，这也部分解释了抽薹高度、单株鲜重以及叶片萎蔫指数之间存在的高度相关性(表3)。Li等[24]也观察到类似现象，他们发现株高抗旱系数、根干重抗旱系数以及总干重抗旱系数的QTL都定位在第1连锁群的相同区域，而且这三个性状之间也显著相关。

4 结 论

利用一个甘蓝型油菜F2∶3群体在抽薹期进行抗旱性鉴定和QTL分析，共检测到28个QTL，其贡献率在1.1%～36.6%之间。其中在LG15连锁群上检测到4个重叠的QTL，贡献率最大为36.6%，在抗旱育种中应重点关注。在LG16连锁群上也检测到4个重叠的QTL，但贡献率在8.1%以下，属于微效QTL，但在育种选择中也应予以考虑。

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