气相色谱-质谱联用测定食用香精香料中15种萜烯醇酯

佟亚楠，李宝志，刘文春，李凤琴，李锋，孙明

（1.吉林烟草工业有限责任公司品质控制部，吉林长春130031；2.吉林烟草工业有限责任公司技术中心，吉林长春130031）

食用香料和香精通常因其具有天然瓜果等的香和味而被广泛应用于现代食品工业，以提高食品品质[1]。食用香料和香精是经常使用的一大类食品添加剂，目前国家食品工业可以使用的食品香料、香精有上千种之多。按照标准规定的用量使用香料和香精一般不会危害人体健康[2]，但过量使用则会带来严重危害。此外，近年来研究发现，一些香料中含有黄樟素等有害成分[3-4]，这些有害成分的存在给食品的安全性埋下了隐患。目前食品行业对产品中所含添加剂进行标注时往往仅简单标注“食用香精”，而不标注具体成分和含量，这不仅不能客观地约束生产企业不规范使用食用香精、香料，且给质量监控造成了困扰[5]。

研究表明，萜烯类化合物及其衍生物是香精、香料的重要成分[6-7]，例如香叶醇和橙花醇，是无环单萜烯醇类化合物，具有温和而甜的玫瑰花香，留香较长，是玫瑰系香精的主剂，且具有抗菌和驱虫等功效，广泛应用于食用香精、日化香精、烟草、药物等领域[8]。香叶醇、橙花醇是非常有价值的天然产物，其酯类化合物是相关香料的重要成分，具有香柠檬、薰衣草样持久香气，使人心旷神怡、清新舒畅，是制备高级香精不可缺少的香料，在日化、食品等工业中具有十分重要的地位[9-11]，被广泛用于配制食品香精、香水香精、化妆品香精、皂用香精等。除香叶醇和橙花醇外，香料和香精中常见的萜烯类化合物及其衍生物还有异丁酸橙花酯、异丁酸香叶酯、2-甲基丁酸橙花酯、异戊酸橙花酯、2-甲基丁酸香叶酯、异戊酸香叶酯、反-2-己烯酸香叶酯、糠酸橙花酯、糠酸香叶酯、苯甲酸橙花酯、苯甲酸香叶酯、肉桂酸橙花酯、肉桂酸香叶酯、肉豆蔻酸橙花酯、肉豆蔻酸香叶酯等。

随着食品、日化等领域对萜烯醇酯的使用量的增加，有必要分析食用香精香料样品中萜烯醇酯的含量，以确保产品的安全性。但因食用香精香料中的成分比较复杂，目前国内外尚未建立香料香精中萜烯醇酯的检测标准，也缺乏分析方法和检测数据[12]。因此，建立香料香精中15种常见萜烯醇酯类化合物的检测方法具有重要理论意义和现实意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Clarus 600气相色谱质谱联用仪：美国PerkinElmer公司；Milli-Q integral 10超纯水仪：美国Millipore公司；AB204-S型电子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；HY-5型回旋式振荡器：江苏荣华仪器制造有限公司。

标准品（异丁酸橙花酯、异丁酸香叶酯、2-甲基丁酸橙花酯、异戊酸橙花酯、2-甲基丁酸香叶酯、异戊酸香叶酯、反-2-己烯酸香叶酯、糠酸橙花酯、糠酸香叶酯、苯甲酸橙花酯、苯甲酸香叶酯、肉桂酸橙花酯、肉桂酸香叶酯、肉豆蔻酸橙花酯和肉豆蔻酸香叶酯）：纯度≥97%，美国Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷、乙醇：色谱纯，德国Merck公司。

1.2 标准溶液的配制

内标溶液：精密称取内标物3-苯丙酸乙酯500.0 mg，用乙醇溶解并定容至100 mL的容量瓶中，得到浓度为5 mg/mL的内标溶液。

15种萜烯醇酯混合标准溶液Ⅰ：分别称取0.1 g（精确至0.1 mg）15种萜烯醇酯标准品，用乙醇溶解并定容至50 mL的容量瓶中，配制浓度为2 mg/mL的混合标准溶液Ⅰ，置冰箱于4℃下保存，有效期3个月。

15种萜烯醇酯混合标准溶液Ⅱ：准确移取10 mL混合标准溶液Ⅰ，置于100 mL容量瓶中，以乙醇稀释并定容至刻度，配制浓度为200 μg/mL的混合标准溶液Ⅱ，置冰箱于4℃下保存，有效期3个月。

标准工作溶液的配制：准确移取 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL混合标准溶液Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，加入50 μL内标溶液，用乙醇稀释并定容至刻度，制得标准工作溶液，其浓度分别为：2、4、10、20、40 μg/mL。

1.3 样品处理

准确称取0.3 g（精确至0.1 mg）食用香精、香料样品于50 mL具塞三角瓶中，分别加入50 μL内标溶液和10 mL乙醇，用漩涡混合器混合均匀，再用超声萃取30 min，加入适量无水硫酸钠充分脱水，静置，取上层清液，经0.22 μm尼龙膜过滤后，得到待测样品溶液，其中内标物在提取液中的浓度为25 μg/mL。

1.4 气相色谱-质谱仪器分析条件

设定GC-MS分析条件，分别对标准工作溶液、样品溶液和空白溶液进行检测分析，具体分析条件为色谱柱：Elite-35MS毛细管色谱柱，固定相：35%苯基/65%甲基聚硅氧烷，规格：60 m×0.25 mm×0.25 μm；进样口温度：280℃；进样量：0.5 μL，不分流进样；载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0 mL/min；升温程序：初始温度60℃，以 5℃/min升温至260℃，保持10 min。质谱分析条件：电离方式：电子轰击源（EI）；电离能量：70 eV；传输线温度：260 ℃；离子源温度：200℃；溶剂延迟：8 min，选择离子扫描模式（SIM）分段扫描，以特征离子进行定量分析；15种萜烯醇酯定量和定性选择离子见表1。

表1 15种萜烯醇酯类化合物定量和定性选择离子Table 1 Retention times，quantitative ions and qualitative ions of the fifteen terpene carboxylates

续表1 15种萜烯醇酯类化合物定量和定性选择离子Continue table 1 Retention times，quantitative ions and qualitative ions of the fifteen terpene carboxylates

2 结果与讨论

2.1 气相色谱条件的优化

色谱柱的填料、规格很大程度上影响检测的效果。增加柱长可使理论塔板数增大，但同时使峰宽加大，分析时间延长。因此，填充柱的柱长要选择适当。一般情况下，柱长选择以使组分能完全分离，分离度达到所期望的值为准。比较了Elite-35MS、Elite-17MS和HP-INNOWAX色谱柱对香精、香料中萜烯醇酯类化合物的分离效果。结果发现，以色谱柱Elite-35MS检测标准工作溶液效果最好，其填料为35%苯基/65%甲基聚硅氧烷，中等极性色谱柱，规格：60 m×0.25 mm×0.25 μm。色谱图如图1所示。结果显示，以该方法检测标准工作溶液，萜烯醇酯类化合物峰形和分离效果较好。

图1 Elite-35MS检测15种萜烯醇酯类化合物混合标准溶液的总离子流图Fig.1 Elite-35MS/TIC of the fifteen terpene carboxylates mixed standard solution

以色谱柱Elite-17MS检测标准工作溶液效果，Elite-17MS色谱柱的填料为50%苯基/50%甲基聚硅氧烷，中等极性色谱柱，规格：30 m×0.25 mm×0.25 μm。色谱图如图2所示。结果显示，以该方法检测标准工作溶液，萜烯醇酯类化合物不能很好的分离，出现目标化合物峰的重叠。

图2 Elite-17MS检测15种萜烯醇酯类化合物混合标准溶液的总离子流图Fig.2 Elite-17MS/TIC of the fifteen terpene carboxylates mixed standard solution

以色谱柱HP-INNOWAX检测标准工作溶液效果，HP-INNOWAX色谱柱的填料：键合/交联聚乙醇，强极性柱，规格：30 m×0.25 mm×0.25 μm。色谱图如图3所示。结果显示，以该方法检测标准工作溶液，萜烯醇酯类化合物不能很好的分离，出现目标化合物峰的重叠，并且，基线出现飘移。

图3 HP-INNOWAX检测15种萜烯醇酯类化合物混合标准溶液的总离子流图Fig.3 HP-INNOWAX/TIC of the fifteen terpene carboxylates mixed standard solution

结果表明，Elite-35MS毛细管色谱柱的峰型和分离效果最好。且本方法试验表明，色谱柱的长度影响样品的分离度，柱子越长分离度越高，信噪比越高。

2.2 方法的线性方程及检出限

标准工作曲线绘制及结果计算：分别取标准工作溶液进行分析，以标准工作溶液中15种萜烯醇酯类化合物和3-苯丙酸乙酯的色谱峰面积比对其相应浓度比进行回归分析，得到标准曲线；取最低浓度工作标准溶液，做10次平行试验，计算标准偏差，3倍标准偏差为检出限，10倍标准偏差为定量限，结果如表2所示。

表2 15种萜烯醇酯类化合物的标准曲线、相关系数、检测限和定量限Table 2 Regression equations，correlation coefficients，limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the fifteen terpene carboxylates

2.3 方法的精密度和加标回收率进行检测

方法的准确度、精密度分别用回收率和相对标准偏差衡量。对同一样品在相同条件下，取样6次，并根据测定结果的平均值计算15种萜烯醇酯类化合物的相对标准偏差（RSD%）；对食用香精、香料样品中，分别添加低、中、高3种水平的标准溶液，标准加入量分别为10、100、500 mg/kg进行加标回收率试验，计算含量的方法为：将相同条件下测得的样品溶液中15种萜烯醇酯类化合物和3-苯丙酸乙酯的色谱峰面积比，代入所绘制的标准曲线，求得样品中萜烯醇酯类化合物的含量，结果详见表3。

从表3可知，15种萜烯醇酯的平均加标回收率在83.4%～113.8%范围内，相对标准偏差（RSD）在2.31%～4.11%之间，表明本方法准确性高，重复性好，适合定量分析。

表3 15种萜烯醇酯类化合物的回收率与相对标准偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the fifteen terpene carboxylates

2.4 实际样品的测定及与标准方法的比较

应用所建立的方法，选取5个食用香精香料样品（样品类型包括表香、精油和浸膏等），测定样品中萜烯醇酯类化合物的含量。不同食用香精香料中萜烯醇酯类化合物的含量见表4。

表4 不同食用香精香料中萜烯醇酯类化合物的含量Table 4 Contents of the fifteen terpene carboxylates in flavor samples mg/kg

结果说明，本试验提供的方法能够快速，准确对食用香精香料中萜烯醇酯类化合物进行定量、定性分析。

3 结论

本文提供一种萜烯醇酯类化合物的气相色谱-质谱联用检测方法，比较了Elite-35MS、Elite-17MS和HP-INNOWAX色谱柱，选择了峰形和分离效果最好的Elite-35MS柱为分离柱，所采用的色谱条件使15种目标化合物及内标色谱峰都分离度较好，并且均具有较好的线性相关性，检出限在1.95 mg/kg～4.01 mg/kg之间，平均加标回收率在83.4%～113.8%之间，相对标准偏差（RSD）均小于5.0%。本方法的回收率高，重复性好，适合于食用香精香料中萜烯醇酯的定性确认、定量分析。

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