上调microRNA-34a抑制胶质瘤细胞的增殖及侵袭

段军伟 唐晓平 张 涛 赵 龙 彭 华 段 劼

胶质瘤是成人常见的中枢神经系统肿瘤，起源于神经外胚层，包括少支胶质瘤、脉络丛瘤、星形细胞瘤、神经元神经胶质混合瘤、胚胎性肿瘤等[1-2]，可引起颅内压升高和脑组织受压，临床表现为头痛、呕吐、视力下降、记忆力减退等症状。目前，手术和放化疗是治疗胶质瘤的常用方法，但存在风险高、副作用大、复发率高、预后差等问题[3-4]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是近几年发现的与肿瘤生长、增殖、侵袭以及凋亡相关的小分子RNA[5]。研究[6]表明，miRNA-34a在非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中缺失或表达下调，说明miRNA-34a表达下调在肿瘤发生发展过程中起到一定作用。本研究旨在检测胶质瘤组织中miRNA-34a表达情况，及对人脑胶质瘤细胞系U251细胞增殖、侵袭的影响，为胶质瘤基因治疗提供可靠理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 采集川北医学院附属医院2013年3月至2017年3月胶质瘤组织标本30例作为观察组，采集重症脑外伤需行手术者正常脑组织标本10例作为对照组。胶质瘤组织标本和正常脑组织标本采集均通知患者及其家属，并自愿签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 细胞与试剂 人胶质瘤细胞系U251(上海江林细胞库中心)，RPMI 1640培养液(美国，Gibco 公司)，10%新生牛血清(美国，Hyclon 公司)，TaqMan microRNA 逆转录试剂盒(上海慧颖生物科技有限公司)，Lipofectamine TM 2000(中国，北京盈丰大通科技有限公司)，四唑盐比色法 (mosmann tetrazoliumtest，MTT) 试剂盒(美国，Sigma公司)，Transwell小室(美国，Invitrogen公司)。

1.3 荧光定量PCR检测miRNA-34a的表达 根据一步法[7]miRNA说明书(北京，天根公司)中步骤提取胶质瘤组织和U251细胞系中总miRNA，然后根据逆转录试剂盒说明书步骤将其转录为cDNA，再进行real-time PCR反应，扩增条件为95℃ 10 min，95℃ 15 s，55℃ 1 min，共38个循环。内参基因为U6，采用2-ΔCt法计算基因相对表达量。

1.4 细胞转染实验 本研究分为3组，Control组(不转染任何基因)、Mock组(转染miRNA-neg序列)和miRNA-34a mimic组(转染miRNA-34a mimic序列)。待U251细胞密度长至80%左右时，根据Lipofectamine TM 2000说明步骤将miRNA-neg(miRNA阴性对照序列)和miRNA-34a mimic(miRNA-34a模拟物)分别转染进U251细胞中。miRNA-neg序列为 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’，miRNA-34a mimic序列为 5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’。

1.5 MTT实验 将U251细胞接种于96孔板中，密度控制在5×104/mL左右，各组细胞在37℃、5% CO2培养箱中分别培养12、24、36、48、56、72 h。每孔加入10 μL MTT，继续培养4 h，每孔加入100 μL 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，震荡10 min，采用分光光度计检测在570 nm处的光密度(D570)值，重复5次，取平均值。以上设置均为实验孔，同时设置对照孔(未接种细胞，仅添加培养基，其他同实验孔)。细胞增殖抑制率=实验孔与空白孔D570值之差/空白孔D570值×100%。

1.6 Transwell实验 U251细胞转染48 h后进行细胞计数，将细胞密度控制在5×104/mL左右，采用24孔板Transwell小室，上室和下室分别加入200 μL细胞悬液和600 μL培养液，培养24 h，取出Transwell板，将上室中残留细胞用脱脂棉签擦去，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)冲洗3～4次，下室采用结晶紫染色20 min，PBS冲洗3～4次后，对膜下方细胞采用100倍显微镜下观察并计数。每组重复3次。

2 结果

2.1 miRNA-34a的表达水平 miRNA-34a在人脑胶质瘤组织中相对表达水平为(0.35±0.07)，低于在人脑正常组织中相对表达水平(1.00±0.13)，差异有统计学意义(t=7.625，P=0.002)。

2.2 各组U251细胞系转染后miRNA-34a相对表达量比较 转染后，实时定量荧光PCR显示，Control组、Mock组、miRNA-34a mimic组miRNA-34a相对表达水平分别为(1.00±0.08)、(0.98±0.11)和(6.19±0.34)，差异有统计学意义(F=604.928，P<0.001)，miRNA-34a mimic组与Control组、Mock组比较，差异有统计学意义(t=25.736、25.252，P<0.001)。

2.3 各组U251细胞增殖情况比较 MMT实验结果显示，在不同时间点，miRNA-34a mimic组U251细胞增殖抑制率高于Control和Mock组，差异有统计学意义(P均<0.05)。详见表1。

表1 各组不同时间点U251细胞增殖情况比较

注：与Control组比较，*P<0.05；与Mock组比较，#P<0.05

2.4 上调miRNA-34a抑制U251细胞侵袭 Transwell实验显示，miRNA-34a mimic组U251细胞侵袭能力低于Control组和Mock组，差异有统计学意义(P<0.05)。Control组、Mock组和miRNA-34a mimic组侵袭细胞数分别为(90.53±5.84)个、(88.21±5.04)个和(27.46±2.76)个,差异有统计学意义(F=171.482，P=0.000)，miRNA-34a mimic组与Control组、Mock组比较，差异有统计学意义(t=16.912、18.311，P<0.001)。详见图1。

图1 Transwell实验检测各组U251细胞侵袭能力

注：A为Control组，B为Mock组，C为miRNA-34a mimic组

3 讨论

miRNA是一种含18～24个核苷酸的高度保守序列，可与靶基因3’非翻译区靶位点特异性识别并结合，调控靶基因表达。研究[8-9]显示，miRNA可调控超过90%的人类基因，可参与胚胎发育以及肿瘤发生过程。根据miRNA在肿瘤发生过程中作用不同，分为促癌miRNA和抑癌miRNA，miRNA-34a是研究相对较早的抑癌miRNA[10]。

miRNA-34a基因位于人源1号染色体短臂，可直接抑制CD44、Fra-1、Bcl-2、SIRT1、CDKs以及原癌蛋白表达，影响细胞增殖、迁移和侵袭，并加速细胞凋亡和坏死，从而达到抑癌目的[11]。张颖等[12]体外实验发现，5637细胞系过表达miRNA-34a后，迁移力、侵袭力下降，增殖能力也受到抑制。庄彪等[13]发现，在转染miRNA-34a的HCT116细胞中，miRNA-34a表达量增加7倍左右，细胞增殖能力下降约50%，细胞侵袭能力下降约60%，认为miRNA-34a抑制细胞增殖、侵袭与调控Bcl-2、MMP-2、MMP-9表达有关。

本研究发现，脑胶质瘤组织miRNA-34a表达量低于正常脑组织，提示下调miRNA-34a表达或miRNA-34a缺失可促进胶质瘤发生，与余肖等[14]研究结果一致。可能原因为：①P53基因发生突变；②人源1号染色体短臂发生缺失，20%～30%星形细胞瘤和70%～85%少突胶质细胞瘤被发现有1号染色体短臂等位基因缺失，而位于人源1号染色体短臂上的miRNA-34a编码基因由于基因缺失，引起表达下调；③miRNA-34a编码基因启动子发生甲基化，部分恶性肿瘤发生与1号染色体短臂缺失有关，而在卵巢癌、肝癌中发现启动子区CpG岛甲基化可抑制miRNA-34a激活，从而引起miRNA-34a表达下调[15-16]。此外，本研究体外转染实验发现，miRNA-34a mimic转染U251细胞后，miRNA-34a表达量上调，进而对转染的U251细胞进行MMT实验和Transwell实验，发现miRNA-34a转染组细胞增殖、侵袭能力均低于Control组和Mock组，提示上调miRNA-34a表达可抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭。

综上所述，上调miRNA-34a对胶质瘤细胞增殖和侵袭具有抑制作用，miRNA-34a可作为胶质瘤发生、发展、评估指标以及基因治疗潜在靶点。

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