绣球花组织培养的研究进展

闫海霞+蒋月喜+邓杰玲+黄昌艳+何荆洲+卜朝阳��

摘要：【目的】对国内绣球花的组织培养研究进行了概述，为绣球花的组织培养提供参考。【方法】从外植体的获得、初代培养、增殖培养、生根培养以及移栽等方面的研究进展进行重点阐述，讨论分析目前绣球花组织培养中存在的问题以及今后的研究方向。【结果】我国的绣球花组织培养研究起步较晚，虽取得了一定进展，并逐步建立了一套绣球花快速繁殖的体系，但仍然存在部分问题。【结论】目前的绣球花组织培养研究仍较欠缺。

关键词：绣球花；外植体；生根

中图分类号：S682文献标识码：A文章编號：1003-4374（2017）03-0039-05

Abstract：【Objective】It aims to summarize the research of the tissue culture of [WTBX]hydrangea macrophylla，and provides reference for its cultivation【Methods】Existing problems in the cultivation of [WTBX]hydrangea macrophylla and the future research directions are elaborated，based on the research progress with the acquisition of explants，primary culture，propagating culture，rooting culture and transplanting【Results】The research on the tissue culture of [WTBX]hydrangea macrophylla in China started lateAlthough some progress has been made and a system for the rapid propagation of hydrangea has been established，problems still exist【Conclusion】At present，the research on tissue culture of [WTBX]hydrangea macrophylla is still deficient

Key words：[WTBX]hydrangea macrophylla；explant；rooting

绣球花（Hydrangea macrophylla）属虎耳草科八仙花属的落叶灌木[1]，别名众多，如草绣球、阴绣球、八仙花、粉团花、紫阳花等，原产日本以及中国四川一带，现世界现各地均有栽培。半阴、温暖湿润的环境是绣球花的极佳生长环境，在富含腐殖质、湿润、排水良好的酸性土壤上生长更好。绣球花可入药，其叶片含有绣球酚和绣球酚8OβD葡萄糖糖苷等成分（Asahina Y，1929）以及甘茶叶素[2]，可见其是具有较高的开发利用价值的。此外，其花朵硕大而艳丽，花色丰富，当土壤pH为4～6时花呈蓝色，当土壤pH为75以上则呈红色，因此可作为测定土壤酸碱度的指示植物[3]。绣球花的繁殖方法以扦插为主，但繁殖系数低，繁殖速度慢，无法满足规模化生产的需要，在一定程度上限制了优良新品种的快速繁殖以及工厂化生产。组织培养繁殖系数大，繁殖速度快，不会因发生变异而使有利变异性状丧失，为满足人们对有利变异的需要提供了可能[4]。国外对于绣球花研究主要集中在欧美、日本，这些国家对绣球花的资源及育种的研究较早，并且培育出了不少的园艺栽培品种，由于缺乏一套适宜的绣球花快繁技术，并未进行大面积推广。国内首次成功报道了绣球花的离体快繁技术是在1998年[5]，随后有关绣球花的组培研究逐年增多。本文主要综述国内外对绣球花的组织培养研究进行，并就现今存在的问题以及今后研究方向提出相应建议，旨在为研究绣球花的组织培养技术，对其育种、良种繁育提供一定的参考。

1外植体的获得

植株的任何一部分均可作为外植体，在绣球花的组织培养研究中，带腋芽茎段、茎尖、叶片、叶柄、叶块是常用的外植体，而种子、根系或花器官为外植体的研究尚未见报道。绣球花最早使用叶片为外植体的是Sebastian与Hearser[6]。冯润东等[7]以茎段、叶片和茎尖为外植体，并将茎段分为中部、下部两种类型，叶片分为成熟叶、嫩叶两种类型进行研究，发现：叶片污染率最低，但不易形成愈伤组织，茎尖污染率较高，但可诱导出侧芽。邢合龙等[8]同样认为叶片不易形成愈伤组织更不能形成不定芽，茎尖虽然污染率略高于但死亡率较低，主要是因为：茎尖本身污染程度低，而其他部位除了嫩叶片都与外界接触时间较长，叶片虽污染少，但不容易形成愈伤组织，更不能快速形成不定芽，与快速繁殖相悖，所以选用茎尖为外植体。还有研究表明，叶柄是适宜的外植体的，如范小峰等[9]通过比较茎段、叶柄、叶块的组培研究发现，茎段、叶柄、叶块均可作为离体培养的外植体，其中叶柄的诱导效果最好。由上可知，外植体的选择受植物自身基因型的决定，同时还受外植体类型、自身状态的影响。

外植体的消毒灭菌是组织培养取得成功的关键一步。消毒剂的种类很多，常用的是将75%酒精和01%HgCl2两者结合使用，还有采用酒精结合次氯酸钠进行消毒灭菌的。酒精穿透力极强，可排除材料上的空气以利于其它消毒剂的进入，因此，酒精通常与其他消毒剂结合使用，并被用作表面消毒的第一步。HgCl2的消毒效果也很好，但灭菌时间过长对培养物会有毒害作用，从而影响外植体的成活率，HgCl2是有毒物质，从环保的角度来说是不利于环保的[10]。研究表明绣球花的外植体消毒采用常规消毒即可达到很好的效果，区别在于消毒剂的灭菌时间长短。雷亚灵[9，10]认为最好的消毒方式为70%酒精浸泡30s后再用01%HgCl2消毒10min。唐晓杰等[12]则以70%酒精消毒30-45s后再利用01%HgCl2灭菌7min，效果最好。任叔辉[13]指出：HgCl2、次氯酸钠及升汞次氯酸钠组合都能很好的起到灭菌消毒效果，但灭菌时间过长，会使外植体部分叶片变黄，甚至出现褐化现象。殷丽青等[14]在进行组培研究时，针对露地栽培植物的器官或组织杂菌多，灭菌困难的情况，采用了一个较特别的方法：在材料萌芽前，先用硫酸纸将枝条顶端套起，待新枝萌芽后取其茎段用75%乙醇处理30s后，再用饱和漂白粉上清液灭菌15-20min，灭菌效果较好，且避免去了使用HgCl2，此方法低碳环保。综上可知，消毒剂的灭菌时间长短对外植体的污染和成活率影响很大，因此在筛选适宜的灭菌方法时，要两者兼顾。

2初代培养

初代培养也称启动培养，指的是将外植体首次接种在培养基上进行培养的阶段，其目的是获得无菌的材料。经过初代培养的外植体可以通过愈伤组织途径或者不定芽途径获得组培苗。愈伤组织途径又叫间接途径，指外植体先脱分化为愈伤组织，再由愈伤组织分化形成丛生芽，然后生根形成完整植株。不定芽途径也叫直接途径，即指不经愈伤组织阶段而直接脱分化产生器官。绣球花的组织培养研究采用两种方法均可进行，但以不定芽途径为主，愈伤组织途径为辅。

21不定芽途径的启动培养

绣球花初代培養以MS培养基为基本培养基，并在MS上添加不同种类和浓度的激素，这类启动培养基有MS+6-BA 05mg/L+IBA 05mg/L[12]、MS+6-BA 30mg/L+NAA 01mg/L[15]、MS+6-BA 10mg/L+NAA 01mg/L+GA3 10mg/L[16]。也有部分研究的初代培养基以1/2MS为基本培养基，在1/2MS上添加不同种类和浓度的激素，如1/2MS+6-BA 01mg/L+NAA 01mg/L是嫩茎侧芽生长的理想培养基[4]。启动培养基中添加的6-BA、NAA、IBA、GA3，其浓度因品种而异。研究表明，6-BA和NAA的浓度配比对茎段的诱导效果不同，高浓度的6-BA会抑制芽的伸长，苗短小瘦弱，而高浓度的NAA也会抑制芽的萌发，在MS+6-BA 05mg/L+NAA 02mg/L培养基上，芽的启动率高，生长较快，且健壮[17-19]。当6-BA浓度大于20mg/L时，芽的诱导受到抑制作用，而当NAA浓度大于05mg/L时，不定芽基部产生愈伤组织并表现出细弱的现象，其中在培养基6-BA 10mg/L+NAA 01mg/L上，芽的诱导率最高，达972%，是适宜的启动培养基[14]。

22愈伤途径的愈伤组织诱导及分化

绣球花的启动也可通过另一种方式发生，即愈伤组织途径。但愈伤组织的诱导和分化受外植体的遗传因素及本身的生理生化影响很大，且因植物种类和部位不同而不同，产生这种差异的主要原因是植物体内的内源细胞分裂素与生长素的绝对含量和相对比例。

愈伤组织的诱导和分化受激素种类及浓度的影响很大。细胞分裂素的主要作用是诱导愈伤组织，生长素则有利于愈伤组织的分化，但单一使用某一种生长素并不利于愈伤组织的分化，将细胞分裂素和生长素合理地配合使用对愈伤组织的分化极为有利。孙晓荣等[20]将绒绣球的茎尖、侧芽或茎段接种到不同的8种培养基上，其中以MS+6-BA 05-10mg/L +IAA 01-02mg/L的分化率最高。范小峰等[9]认为适合绣球花愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+6-BA 10-20mg/L+NAA 005mg/L，诱导率达875%，适合愈伤组织分化的最佳培养基为MS+6-BA 20mg/L+NAA 05mg/L。雷亚灵[10]（2008a）经过深入研究发现：最佳愈伤组织诱导培养基为：MS+6-BA 10mg/L+IBA 10mg/L，诱导愈伤率达92%。最佳愈伤组织增殖培养基为：1/4MS+6-BA 05mg/L+IBA 02mg/L，增殖系数可达92；最佳的愈伤组织分化培养基为：MS+TDZ 01mg/L+IBA 05mg/L，分化率达48%。韩玉林[21]经过相关实验表明：诱导愈伤组织形成的培养基为MS+6-BA 20mg/L+NAA 01mg/L，不定芽分化的培养基为MS+6-BA 20mg/L+NAA 01mg/L。由上可知，绣球花的愈伤诱导与分化通常采用的细胞分裂素为6-BA，生长素则以IBA或者NAA为主。

3增殖培养

快繁是指快速繁殖，增殖培养是快繁的决定性因素，影响快繁的主要因子是增殖培养基的选择，其中包含基本培养基以及培养基中的激素组合以及浓度配比。增殖培养中不同的激素配比对侧芽的形成效果不同，激素过少不能促进侧芽的形成和生长，激素过多会抑制侧芽的形成和生长。增殖培养中的激素组合以细胞分裂素和生长素为主，常用的组合是6-BA和IBA，如雷亚灵[10，12]以MS+6-BA 05mg/L+IBA 03mg/L和S+6-BA 30mg/L+IBA 01mg/L为适宜的增殖培养基；冯润东等[7]以MS+6-BA 10mg/L+IBA 012mg/L为理想的增殖培养基；而邢合龙等[8]则以MS+6-BA 10mg/L+IBA 01mg/L为最佳增殖培养基。此外，MS+6-BA 10mg/L+IBA 005mg/L[22]、MS+6-BA 10mg/L+IBA 01mg/L[12]都能够使绣球花的增殖效果明显。从上述研究可以得出，增殖培养基中添加6-BA的浓度范围是05-30mg/L，而IBA的浓度则控制在005-03mg/L之间。6-BA配合IBA并不是唯一的最佳组合配比，很多研究的激素组合是以6-BA和NAA为主。姜巍等[4]研究得出不定芽理想的增殖培养基为1/2MS+BA 05mg/L+NAA 01mg/L；段新玲等[23]经筛选，用MS+6-BA 10mg/L+NAA 01mg/L或MS+6-BA 20mg/L +NAA 02mg/L作为增殖培养基。NAA和6-BA的浓度在一个合理范围内才有利于增殖的发生，此时不定芽数量多，植株长势旺盛，苗粗壮，叶色浓绿[15]。NAA和6-BA的浓度不能太高，否则会抑制不定芽的加粗伸长生长，从而使不定芽矮小细弱呈丛生状态。此外，高浓度的NAA会使不定芽过早地生根[7]。细胞分裂素6-BA配合低浓度的IAA、NAA效果较好，如在MS+6-BA 10mg/L+NAA 02mg/L和MS+6-BA 10mg/L+IAA 01mg/L培养基上，容易形成不定芽，其长势好，植株健壮[13]，主要原因是在不定芽增殖继代的培养中随着6-BA浓度增加，分化率提高，但生长势减弱，而IAA、NAA在一定范围内对增殖和伸长的影响不显著，但浓度过高则会对嫩芽的增殖和伸长产生抑制作用。除了上述涉及的激素以外，还有研究涉及了三种不同种类的激素，在以6-BA 和NAA为主的基础上附加其他激素。如：MS+6-BA 22mg/L+NAA 01mg/L+GA 05mg/L、MS+6-BA 30mg/L+NAA 01mg/L+GA 05mg/L+活性炭10 g/L、MS+6-BA 30mg/L+NAA 02mg/L+GA 05mg/L+活性碳10g/L，这三种培养基都适宜绣球花的增殖培养[15]；王忠武[16]采用MS+6-BA 05mg/L+NAA 004mg/L+腺嘌呤50mg/L作为增殖培养基也获得了较高的增殖系数。多数研究中的各种增殖培养基均添加生长素，而殷丽青[14]在绣球花的增殖培养中，适宜的增殖培养基为改良MS+6-BA 10mg/L，并未添加生长素，她认为生长素对绣球花的启动培养具有一定的促进作用，但对增殖影响不明显，添加生长素还容易使培养物基部生长根毛，从而影响增殖培养的无菌操作。

4生根培养

瓶内生根和瓶外生根是组培生根培养的两种方式，而瓶外生根一般是针对生根困难的物种。绣球花的生根培养以瓶内生根的研究占多数。基本培养基则大部分以1/2MS为主，极少用到MS。生根培养基中附加不同种类和浓度的植物生长激素可以使生根更容易，常用的有IBA（浓度为02～10mg/L，以02～03mg/L为主）和NAA（浓度为01～03mg/L），少量用到IAA。任叔辉[13]认为在1/2MS培养基中添加NAA和IBA都能促进根的形成，但随着浓度的提高，生根率明显下降，侧根生长明显降低，而其研究结果则以1/2 MS+IBA 01mg/L为最佳生根培养基。在范小峰[9]的研究中，同样是在1/2 MS培养基上添加IBA，添加浓度为05mg/L，在此浓度范围内，生根效果最好，生根最早，根数多，生根率达100%，且植株生长粗壮，而当IBA改为IAA时，虽然根较粗壮，但是生根时间慢，生根率较低，最高达909%，可见IAA效果不及IBA，若将两种生长激素配合使用时，生根率达100%，根数也较多，但根细弱，会影响后期的移栽成活率。韩玉林[21]研究表明4/5MS+6-BA 20mg/L+NAA 01mg/L有利于组培苗不定根的形成。绣球花瓶外生根的研究近年也有相关报道。龚伟等[3]将组培苗扦插于预先经福尔马林消毒处理好的瓶外生根基质珍珠岩∶蛭石=1∶1上，在湿度大于85%的条件下进行培养，生根率达100%。吴华芬等[22]采用与龚伟相同的瓶外生根方法，研究结果是相一致的。瓶外生根相对于瓶内生根而言，由于省去了生根培养这一阶段，其培养程序得到了简化，节约了生产时间，同时也降低生产成本，是工厂规模化生产的有效途径之一。

5炼苗移栽

炼苗移栽是组织培养的最后一个阶段，炼苗的常规做法是：先将组培苗置于室外自然条件下炼苗2～3d，目的是使其适应外部的环境条件，有利于之后的移栽，然后取出洗净基部培养基，并用一定濃度的杀菌剂进行组培苗的杀菌，即可移栽到基质上。移栽后的工作主要是环境温湿度的控制，以及土壤的水肥管理。

大多数组培苗的相关研究主要围绕移栽基质的种类和配比进行。所用移栽基质的主要成分有河沙、珍珠岩、蛭石、泥炭等。移入河沙中，成活率达95%[20]。移入珍珠岩∶腐殖土=1∶2，成活率达80%以上[12]。移栽到珍珠岩∶蛭石=1∶1，成活率为896%（龚伟等，2003）。在珍珠岩∶蛭石=1∶2基质上，成活率可达100%[10]。采用基质蛭石∶珍珠岩=1∶1也可保证移栽的成活[16]。采用营养土配方为腐殖土、珍珠岩、有机肥体积比为3∶2∶1，成活率可达98%，且长势良好[9]。姜巍等[4]将组培苗进行炼苗后，再分别移栽到6种不同的基质，结果表明炉灰渣、1/2珍珠岩+1/2蛭石两种基质中效果最佳，成活率分别为975%、950%，但从移栽基质的来源与试管苗的长势看，炉灰渣好于1/2珍珠岩+1/2蛭石。

6讨论与展望

绣球花用途广，观赏价值高，既可做园林绿化又可做盆花切花，是著名的观赏花卉。绣球花具有多元化的色彩，这个特点非常符合我国彩色苗木产业发展的需求。我国的绣球花组织培养研究起步较晚，通过多年的努力，现已逐渐取得了一定进展，并逐步建立了一套绣球花快速繁殖的体系。目前主要存在以下几个问题：外植体的类型比较单一，仅局限于茎叶；不定芽的分化率低，尤其是以叶片为外植体，通过叶片产生愈伤从而诱导分化不定芽的愈伤分化率较低。今后的研究应该在多方面开展，例如多以绣球花叶片为外植体的高效再生途径，为绣球花高效遗传转化体系的建立奠定基础，以及今后的基因工程选育优良园林品种提供技术参考。

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