独活寄生汤调控对大鼠椎间盘软骨细胞Wnt/β—catenin信号通路的影响

刘伯龄+陈齐勇+付长龙+刘少强+叶小伟+梁清+叶锦霞+李西海

【摘 要】目的：從Wnt/β-catenin信号通路探讨独活寄生汤水提物对大鼠椎间盘退变软骨细胞功能的影响。方法：①用水提加热回流法制备独活寄生汤水提物成分；②选取4周龄健康雄性SD大鼠30只，采用机械-酶消化法分离大鼠椎间盘软骨组织，建立软骨细胞体外培养体系并进行鉴定；③RT-PCR、Western blot法分别检测经DKK-1抑制剂干预及（或）经白细胞介素-1β诱导的椎间盘软骨细胞Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量的表达。结果：①椎间盘软骨细胞经Ⅱ型胶原法染色后，阳性对照组胞浆区域浸染为棕黄色；②RT-PCR、Western blot检测结果示，与正常组比较，模型组Wnt4、GSK-3β、

β-catenin mRNA与蛋白含量表达显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，独活寄生汤水提物组（100，200，400 μg·mL-1）的Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达显著降低（P < 0.01或P < 0.05），其中以200 μg·mL-1组的表达量最低（P < 0.01）。结论：独活寄生汤水提物组可通过调控Wnt/β-catenin信号通路，下调大鼠椎间盘退变关节软骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达，从而延缓椎间盘软骨细胞退变。

【关键词】 椎间盘退变性疾病；椎间盘软骨细胞；独活寄生汤；Wnt/β-catenin信号通路；大鼠

Effect of Duhuo Jisheng Tang（独活寄生汤）on the Regulation of Rat Intervertebral Disc Chondrocyte Wnt/β-catenin Signaling Pathway

LIU Bo-ling，CHEN Qi-yong，FU Chang-long，LIU Shao-qiang，YE Xiao-wei，LIANG Gui-qing，YE Jin-xia，LI Xi-hai

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Duhuo Jisheng Tang（独活寄生汤）water extract on the regulation of rat intervertebral disc chondrocyte Wnt/β-catenin signaling pathway.Methods：①Duhuo Jisheng Tang water extract was made by the water extraction and reflux method.②A total of thirty four-week-old healthy male SD rats used to isolate intervertebral disc cartilage tissue by mechanical enzymatic digestion method to establish in vitro culture system of chondrocytes for identification.③RT-PCR，Western blot were used to detect the expression of contents of Wnt4，GSK-3β and β-catenin mRNA intervened by DKK-1

inhibitor and induced by interleukin -1β.Results：①After typeⅡcollagen staining，the cytoplasmic domain of the intervertebral disc cartilage cells in the positive control group was disseminated yellowish brown.②RT-PCR and Western blot detect results showed that compared with the normal group，the expression of contents of Wnt4，GSK-3β，

β-catenin mRNA and protein increased significantly in the model group（P < 0.01）.Compared with the model group，the expression of contents of Wnt4，GSK-3β，β-catenin mRNA and protein in the Duhuo Jisheng group（100，200，400 μg·mL-1）decreased significantly（P < 0.01 or P < 0.05），

among which the content expression in the group of 200 μg·mL-1 was the lowest（P < 0.01）.Conclusion：Duhuo Jisheng Tang water extract can delay the cartilage cell degeneration of intervertebral disc by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway and down-regulating the content expression of Wnt4，GSK-3β，β-catenin mRNA and protein in degenerated articular cartilage of rat intervertebral disc.endprint

【Keywords】 degenerative disc disease；intervertebral disc chondrocyte；Duhuo Jisheng Tang（独活寄生汤）；

Wnt/β-catenin signaling pathway；rats

椎间盘退变性疾病（如腰椎间盘突出症）的根本病理变化是椎间盘退变，其中软骨终板作为椎间盘的重要组成部分，在维持椎间盘正常功能方面发挥重要作用。近年来，软骨终板退变作为椎间盘退变的始动因素成为新的热点[1-2]。研究证实，椎间盘退变关键因素之一是椎间盘软骨细胞功能偶联失衡，导致持续病理发生，凋亡与细胞分化异常，进而诱导软骨塑形重建，椎体骨赘形成[3]。目前对椎间盘退变规律的研究较为滞后，确切的发病机制和发展过程仍有待进一步探讨，临床往往采取被动的、对症式的治疗措施，在这些治疗中，中医药是有效、安全、不良反应少的常用方法，但迫切需要继续深化其预防和治疗机制的研究。

Wnt信号转导途径调节控制着许多生命过程，包括生物体的生长、发育、疾病、衰老与死亡等；也包括细胞形态与功能的分化与维持、免疫、应激、细胞癌变与细胞凋亡等[4]。在脊椎动物骨骼系统发生过程中，Wnt家族的各成员在骨与软骨发育过程中具有重要调节作用，其中Dickkof族（DKK-1）

作为该信号通路的抑制剂，可抑制Wnt与膜受体的结合，进而阻断该信号通路[5-8]。

独活寄生汤出自唐·孙思邈《备急千金要方》，由独活9 g，桑寄生、杜仲、茯苓、肉桂心、细辛、防风、川芎、牛膝、当归、人参、秦艽、白芍、熟地黄、甘草各6 g组成，具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功效[9]。诸药合用，使外邪得除，肝肾得补，气血得充，邪正兼顾，祛邪不伤正，扶正不留瘀，发挥“从本治痿，从标治痹”作用，切中椎间盘退变性疾病的病因病机。该方长期用于临床，治疗椎间盘退变性疾病有较好疗效[10-11]。前期实验研究表明其能延缓软骨退变[12-13]，但作用机制有待进一步研究。因此，本文从Wnt/β-catenin信号通路探讨独活寄生汤水提物调控对大鼠椎间盘退变软骨细胞功能的影响，有目的地调控其功能，对延缓软骨终板以及椎间盘退变有着重要的基础与应用价值。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级健康SD雄性大鼠30只，体质量90～100 g，由福建中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK2014-0001（闽）。

1.2 实验药物及主要试剂 独活寄生汤（福建中医药大学附属第三人民医院）；磷酸盐缓冲液、DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）；TRIZOL（美国life）；异丙醇、无水乙醇（国药集团）；琼脂糖（Biowest Agarose）；核酸染料（Solarbio）；逆转录试剂盒、DNA Marker Ⅱ（北京全式金生物技术有限公司）；WB玻板（美国BIO-RAD）；PMSF（蛋白酶抑制剂）、RISF（裂解液）、蛋白上样缓冲液（Thermo）；30%聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8与pH = 6.8）、SDS（十二烷基磺酸钠）、10×电泳液、AP（过硫酸铵）、TEMED、50×TAE（碧云天生物有限公司）；10×TBST（Solarbio）；高效封闭液（康为世纪）；Wnt4、GSK-3β、β-catenin、GAPDH引物（上海生工）；一抗（兔抗）Wnt4、GSK-3β、β-catenin、β-actin（美國Abcam公司）；二抗（羊抗兔）（美国CST公司）；1-StepTMTransfer Buffer、ECL高效显影液（美国Thermo）等。

1.3 主要仪器 DNA扩增仪（9600型，美国PE）；低温高速离心机（64R型，美国BECKMAN）；超纯水装置（MILLI-Q型，美国MILIPORE）；荧光倒置相差显微镜（Olympus，日本TKO）；无菌操作台（AIRTECH型，苏州安泰）；超净工作台（SW-CJ-1F型，苏州安泰）；凝胶成像系统（GELDOC2000型，美国BIO-RAD）；全自动酶标仪（BIO-TEK ELX800型，美国BIO-Tek）；CO2恒温培养箱（BB16/BB5060型，德国Heraus）等。

2 实验方法

2.1 独活寄生汤水提物的提取 称取独活9 g，桑寄生、杜仲、茯苓、肉桂心、细辛、防风、川芎、牛膝、当归、人参、秦艽、白芍、熟地黄、甘草各6 g，水回流提取2次，每次2 h，合并提取液，抽滤，浓缩成浸膏，60 ℃水浴蒸干至恒重，待经低温下研磨成粉末状，精确称量浸膏50 mg，加入质量分数为5%的FBS培养基5 mL溶解，超声10 min，再经0.22 μL无菌滤嘴过滤后，4 ℃冰箱保存备用，配成10 mg·mL-1独活寄生汤水提物母液，备用。

2.2 软骨细胞的分离、培养与鉴定 质量分数为10%的水合氯醛麻醉下脱颈椎处死SD大鼠（每次5只），分离颈、腰椎椎间盘软骨终板，收集后经剪碎至每单位体积1 mm3，PBS缓冲液冲洗至少

3次后移至无菌小培养皿中，按每皿2.5 mL加入质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶进行消化，

15 mL离心管收集消化后的上清液（2 h 1次），

1500 r·min-1离心机离心5 min后弃上清液，移液器代液（含质量分数为10%的胎牛血清DMEM）状态缓慢吹匀沉淀，经计数板计数（2×105·mL-1）

后种植原代软骨细胞于培养瓶进行培养，经48 h后初次换液，镜下观察细胞铺满80%瓶底面积时，经胰酶消化进行细胞传代，本实验使用第2代软骨细胞。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：软骨细胞（经计数每毫升2500个）待爬片后，经PBS冲洗3次，

质量分数为4%的多聚甲醛固定30 min，再经冲洗、裂解（0.1%破膜剂50 μL）20 min，冲洗后加入endprint

50 μL质量分数为3%的H2O2反应20 min，再次冲洗后经质量分数为5%的BSA封闭30 min，阳性对照组加入含Ⅱ型胶原1∶200的一抗反应过夜，阴性对照组加入PBS作为对照，后经PBS冲洗3遍

后加入50 μL二抗（1∶200）反应30 min，再次冲洗后以每张玻片50 μL DAB浸润10 min，再依次经过漂洗、苏木素复染、冲洗（PBS）、返蓝2 s、常温晾干、梯度酒精、二甲苯进行脱水与透明后封片与观察[6]。

2.3 实验分组 本实验使用第2代软骨细胞，经鉴定后共分6组，分别为正常组，模型组，DKK-1抑制剂组，以及独活寄生汤水提物低、中、高剂量组。除正常组外，其余各组均经10 ng·mL-1浓度IL-1β造模，造模成功后，DKK-1抑制剂组加入

5 μg·mL-1浓度的DKK-1，独活寄生汤水提物低、中、高剂量组分别加入100，200，400 μg·mL-1的独活寄生汤水提物。

2.4 RT-PCR法检测Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA

2.4.1 Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA引物设计与合成

2.4.2 RT-PCR方法 采用Trizol法进行Total RNA提取，并使用核酸蛋白检测仪进行浓度检测；逆转录后进行PCR，依次使用移液枪准确加入Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DEPC水7 μL、cDNA 1 μL配制公共管，即每管20 μL。PCR为94 ℃ 4 min条件下首先进行预变性，循环35次（94 ℃ 30 s、退火58 ℃ 30 s、72 ℃

45 s），后置于72 ℃ 10 min，并于4 ℃保存；制备1.5%琼脂糖凝胶，上样后，在100 V、70 mA、15 min条件下电泳，使用BIO-RAD Fluor-S TM MultiImager图像分析仪下扫描，经分析后拍照存档。

2.5 Western blot检测软骨细胞Wnt4、GSK-3β、β-catenin表达 独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）干预48 h后，提取各组软骨细胞总蛋白，并进行BCA蛋白定量；依次配制12%分离胶和5%浓缩胶并进行灌板，快速插入梳子，排除气泡后，置于室温下凝固；上样后进行电泳，采用半干式进行转膜，转膜完毕后，迅速取出膜并标记蛋白面，后将其置于TBST中漂洗2遍。脱脂牛奶封闭2 h后洗膜，再将各条膜放入预先配置好的β-actin（1∶1000）、Wnt4（1 μg·mL-1）、GSK-3β（1∶5000）、β-catenin（1∶4000）的一抗中4 ℃冰箱摇床震荡过夜，漂洗3次（每次

10 min）后置于二抗（1∶5000）封闭袋中室温反应1 h，再次漂洗3次（每次10 min），最后配制ECL发光液进行显影，在凝胶成像仪下曝光成像并分析储存。

2.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以表示，2组间比较符合正态分布采用t检验，3组及以上组间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 软骨细胞观察与鉴定 本实验第2代大鼠椎间盘软骨细胞镜下观察：分布均匀，边界清晰，形态结构一致，呈明显的铺路石状外观；經Ⅱ型胶原法染色后，阳性对照组胞浆区为棕黄色，阴性对照组胞浆区颜色透明，以上可鉴定本实验所用细胞为椎间盘软骨细胞。见图1。

3.2 RT-PCR检测结果 RT-PCR检测结果显示，独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）作用于经IL-1β诱导退变的椎间盘软骨细胞后，可下调Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量表达。与正常组比较，模型组Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.01），

提示椎间盘软骨细胞在一定程度上发生退变，退变模型建立；而预加入DKK-1抑制剂组的Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量明显低于模型组

（P < 0.01），提示预加入DKK-1抑制剂可在一定程度上抑制椎间盘软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路；在Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA指标上，与模型组比较，独活寄生汤水提物组（100，200，400 μg·mL-1）的mRNA含量均明显降低，尤其以200 μg·mL-1组的表达量最低（P < 0.01），提示独活寄生汤水提物可通过调控Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA表达，在一定程度通过调控Wnt/β-catenin途径，进而延缓大鼠椎间盘软骨细胞的退变进程。见图2。

3.3 Western blot检测结果 Western blot检测结果显

示，独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）

作用于经IL-1β诱导退变的椎间盘软骨细胞后，可下调软骨细胞内Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量表达。与正常组比较，模型组Wnt4、GSK-3β、

β-catenin含量均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.01），提示软骨细胞在一定程度上发生退变，退变模型建立；而预加入DKK-1抑制剂组的Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量明显低于模型组（P < 0.01）；在Wnt4、GSK-3β、β-catenin指标上，与模型组比较，独活寄生汤水提物组（100，200，400 μg·mL-1）的蛋白含量均明显降低，尤其以200 μg·mL-1组的表达量最低（P < 0.01），提示独活寄生汤水提物可通过调控Wnt4、GSK-3β、β-catenin表达，在一定程度上调控Wnt /β-catenin途径，进而延缓大鼠椎间盘软骨细胞的退变进程。见图3。endprint

4 讨 论

Wnt/β-catenin信号途径与软骨细胞的退变具有密切联系[14-15]，其是否也在椎间盘软骨细胞退变过程中发挥重要的调控作用是我们关注的焦点。因此，本研究通过体外培养大鼠椎间盘软骨细胞，并经Ⅱ型胶原法染色进行鉴定。鉴于IL-1β可抑制软骨细胞活性，并下调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原基因表达，同时亦可诱导细胞外基质蛋白酶、炎症因子和NO产物产生[16-17]，因此本实验使用10 ng·mL-1浓度IL-1β干预椎间盘软骨细胞。结果发现，与正常组比较，模型组在Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量均明显升高（P < 0.05），因此，IL-1β可作为一种塑造大鼠椎间盘软骨细胞退变模型的方式。Dickkof族（DKK-1）可通过间接减少可利用的辅助受体LRP的数量抑制Wnt与膜受体的结合而发挥作用，常被作为Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，因此本实验采用5 μg·mL-1浓度的DKK-1影响Wnt/β-catenin信号通路[18-20]，结果发现，5 μg·mL-1浓度的DKK-1可抑制经IL-1β诱导大鼠椎间盘软骨细胞中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达。

前期研究发现，独活寄生汤水提物200 μg·mL-1

可显著促进正常软骨细胞内Cyclin D1、CDK4、CDK6及P21 mRNA的表达[21]，故本实验在前期基础上，以Wnt/β-catenin信号通路为基点，探讨独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）调控IL-1β诱导的大鼠椎间盘退变软骨细胞功能的影响，结果显示，独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）干预IL-1β诱导的大鼠椎间盘退变软骨细胞48 h后，可明显下调Wnt4、

GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达，其中以200 μg·mL-1组的表达最为显著（P < 0.01），这也与前期研究相切合，提示独活寄生汤水提物可通过影响Wnt/β-catenin途径，进而调控Wnt4、GSK-3β、β-catenin表达，在一定程度上延缓大鼠椎间盘软骨细胞的退变进程。

本实验研究的重点在于独活寄生汤水提物对体外培养的大鼠椎间盘软骨细胞影响，其药理药效作用是否亦可经过体内代谢而对椎间盘发挥影响，仍需要进一步通过大量动物实验进行验证。

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收稿日期：2017-08-20；修回日期：2017-09-28endprint