动脉粥样硬化斑块内间质微环境与新生血管生成关系的最新研究进展

房昊 吴丹 安毅 综述 李丹 审校

(1.青岛大学医学部研究生院，山东 青岛 266003；2.日照市人民医院超声科，山东 日照 276800；3.青岛大学附属医院心血管内科，山东 青岛 266003)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的易损斑块不稳定性与斑块内的血管新生密切相关。AS斑块间质微环境可以通过一系列的调控机制激活大量的相关因子，使其内部生成许多壁薄的、不成熟的微血管，促进AS病变的发展，诱发易损斑块的形成和破裂、出血、直线性增加并发症的风险，因此，深入探讨AS斑块内新生血管的结构功能以及具体的分子调控原理，有效抑制斑块内微血管的形成和提高斑块稳定性，对AS疾病的预防和诊疗有突破性意义，也成为近几年的研究热门。

1 新生血管周围间质微环境研究概况

1.1 新生血管周围间质的作用

目前很多研究已经证明：新生血管周围间质与组织微循环的建立有密切关系，它包括成纤维细胞、细胞外基质，还有少量的免疫细胞等，生命体在组织受损后的自行修复或者在肿瘤发病的情况下，新生血管间质中成纤维细胞的性状会发生剧烈变化，逐渐演变分化为肌成纤维细胞。这种细胞表达基因较稳定、药物易感，并且其表达的多种细胞因子如转化生长因子(TGF)-α、人胰岛素样生长因子1 、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、黏附分子(如细胞间黏附分子-1、纤维粘连蛋白)、蛋白酶[调节蛋白、基质金属蛋白酶(MMPs)-1，2，9]等在促进肿瘤血管新生及侵袭中扮演着重要角色，肌成纤维细胞这种特点使其成为研究肿瘤间质微环境中重要的靶点。与此同时，研究发现在肿瘤的基质中，成纤维细胞激活蛋白呈阳性占成纤维细胞的50%以上，这些成纤维细胞激活蛋白+基质细胞几乎全部散布在血管内皮细胞上，靶位较多，靶向药物易达到，因此成纤维细胞激活蛋白成为了前景广阔、研究价值巨大的抗间质靶分子，目前已经进入了Ⅱ期临床研究，取得了初步研究成果[1]。

1.2 新生血管与周围间质微环境初步猜想——“树根”与“土壤”

目前临床上缺乏对AS内新生血管有效的治疗措施,而且其确切发生机制尚不清楚，与炎症、缺氧及其诱导因子、促/抗血管生成因子的平衡均有关系。大量研究证据认为在肿瘤的生长过程中，机体正常组织间质会被活化，这种活化的间质“土壤”环境促进了肿瘤新生血管的生长侵袭。研究人员提出了肿瘤间质微环境的理论，通过以间质微环境为靶点抑制肿瘤新生血管的形成，在源头上抑制肿瘤的侵袭生长，目前研究已取得了初步成果[2-3]。关于间质微环境在肿瘤新生血管形成中的作用还有很多没有涉及的领域，有待于进一步研究。AS斑块内新生血管的形成亦需要血管内皮细胞突破间质微环境这一重要屏障，同时又需要间质微环境重构为血管新生构建支架。正常的间质微环境并不会诱发新生血管形成，只有在间质微环境发生改变时才会给血管新生创造有利的“土壤环境”。由此相关研究人员得到启发，新生血管是否需要有特殊营养的“土壤” ——血管周围间质微环境才能生长；不同的“土壤”微环境是否会造就不同形态的新生血管；改变“土壤”的性质是否就能阻止新生血管的生长，建立初步猜想之后，这个想法成为了研究热点。

2 新生血管的形成过程

新生血管生长大体分为四个过程：新生、修饰、重构、分化。在这四个不同的阶段，会有相对应的促新生血管形成因子参与调节[2-5]。(1)血管新生雏形阶段：血管内皮细胞在VEGF和血管生成素-2诱导下出芽[6]。(2)血管新生修饰加固阶段：它需要一系列的分子途径调控，促使周细胞的迅速分裂增殖并产生大量的细胞外基质，加快新生血管成熟速度。其中主要途径包括以下三条：①血管生成素-1/Tie-2途径：这种分子通过持续的强化内皮细胞与周细胞间的连接紧密性，能够有效的加强新生血管的稳定性，降低血管的通透性[7]。②血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)途径：血管内皮细胞在诱导下可以分泌PDGF，进而促进血管周细胞增殖生长[8]。③TGF-βl途径：TGF-βl是一个多功能细胞因子，这个途径同样可以有效的加固血管，促进血管成熟[9]。(3)血管新生分支重构阶段：在这一阶段中各种不同的因子调节细胞外基质和基膜，例如蛋白酶类因子(MMPs-2，-3，-9)可调控血管内皮细胞和血管壁细胞在周围间质中的移行[10]。(4)血管新生分化阶段：不同的器官或组织中新生血管会按照预定的方向进行分化，形成各式各样的动静脉及血管网。从以上新生血管的不同阶段可以总结出，调节控制新生血管的分化和形成的主要靶点有三个，包括血管内皮细胞、血管周细胞、细胞外基质。许多不同因子的调节在此过程中也成为了不可或缺的部分。

3 不同靶点的研究现状

随着研究的深入，对三个主要靶点(血管内皮细胞、血管周细胞、细胞外基质)认识程度也渐渐加深。

3.1 血管内皮细胞

将血管内皮细胞作为生长抑制靶点，可有效地将新生血管的形成和生长遏制在雏形阶段。目前它也是研究人员耗时最多、最投入的一个重要靶点。

3.1.1 降低促VEGF的作用

(1)1999年Fong等[11]研究发现一种可以明显抑制肿瘤组织的血管新生的抑制剂——SU5416，它是通过阻断VEGF受体酪氨酸激酶的激活来实现的。这种抑制剂能够阻断VEGF与内皮细胞受体结合，导致受体无法自磷酸化，使得血管内皮细胞无法释放血管生成拟态激活因子，不能生成二酰甘油(DAG)。而DAG可激活细胞质中蛋白激酶C进而刺激内皮细胞增殖、生长，促进血管形成，增加血管渗透性[12]。目前，科学家主要通过基因治疗的方法降低促VEGF的作用。2003年Takeda等[13]在大鼠的角膜中进行实验，发现应用SU5416同样可以有效地抑制角膜新生血管的生成。他们通过调控基因的方法使VEGF及其所诱发的一系列因子减少，达到抑制新生血管形成的目的。 最新研究将VEGF作为靶点，利用小分子干扰RNA来有效地控制角膜的小血管新生[14]，从侧面佐证了Takeda的实验成果。(2)血管生成素，包括血管生成素-1和血管生成素-2，它们共同的受体是Tie-2主要位于血管内皮细胞，两者相互协调、共同维持稳态，在新生血管重构过程中起重要作用。在血管新生期，血管生成素-2可以选择性阻断血管紧张素1/Tie-2的信号传递，分别导致细胞外间质和支持细胞，血管内皮细胞之间的结合紧密度出现明显降低，促使血管内皮细胞更容易接收由VEGF发出的出芽信号，快速突破细胞外基质的限制，以出芽的方式形成新生的微血管；在血管成熟期，血管紧张素1与VEGF协同募集血管周围大量的平滑肌细胞和周细胞，保持血管管腔的稳定性；在血管消退期，由于缺乏关键的VEGF信号传导，血管生成素2会导致散布在血管周围的间质细胞、周细胞与血管内皮细胞失去联系，随后血管内皮细胞很快自行启动凋亡程序，新生血管结构塌陷。存在VEGF时，血管生成素2诱导血管形成；缺乏VEGF时，血管生成素2诱导血管消退[15]。

与此同时，大量的研究发现Tie-2受体的激活在血管生成中扮演了不可或缺的作用。由于血管紧张素1广泛分布于全身的多种细胞，而Tie-2局限于内皮细胞，所以选择Tie-2作为靶点，可以更有针对性抑制新生血管形成。

3.1.2 提高抑制VEGF的作用

血管抑素与内皮抑素是内源性血管生成的两个重要抑制因子，进一步的研究发现血管抑素和内皮抑素对抑制内皮细胞增殖和迁移有较高的特异性。

最新研究表明：内皮抑素特异性地抑制内皮细胞增殖和迁移的机制是：它的结构中有一肝素结合部位，可以与纤维母细胞生长因子竞争内皮细胞受体，从而阻止内皮细胞分裂增殖。然而内皮抑素抗血管生成活性完全取决于金属辅助因子Zn2+的数量，具体机制还在进一步研究中。与内皮抑素相比较，血管抑素作为抑制剂的特异性偏弱一些，它可能只存在于内皮细胞表面的ATP合酶相结合，从而抑制内皮细胞的增殖迁移[16]。这两种新型的新生血管抑制剂在肿瘤防治方面的研究进展较大。

随着研究的进一步深入，Cao等[17]在血浆纤维蛋白溶酶原中提取了Kringle 1～5蛋白水解片断，这种水解片段具有极强的抗新生血管的活性，它在抑制内皮细胞增生、迁移方面比血管抑素强数十倍。同时研究发现Kringle 1～5有抑制角膜新生血管的作用。色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是另一个具有极强抗血管活性的重要因子，它在维持受损斑块无血管的状态中至关重要。研究人员在实验大鼠没有血管的稳定斑块组织中，滴入PEDF抗体后，新生血管会迅速侵入大鼠的斑块内，明显增加了不稳定性，这可能与PEDF抗体可以阻断新生血管内皮细胞FasL的表达，进而切断内皮细胞凋亡信号传导链有关。

3.2 周细胞

周细胞又称Rouget细胞和壁细胞，是一种具有收缩功能且包围着血管内皮细胞的细胞。关于周细胞研究较多，它本身具有很多功能：(1)感知组织的生理需要和血管生成刺激的存在；(2)感知血流动力学改变；(3)沉积、降解细胞外基质；(4)参与旁分泌。随着研究发现，周细胞能够在血管生成的加固阶段起到至关重要的作用，抑制周细胞生长可导致无法加固的新生血管形成渗漏或消失。病理性的血管生成可能导致很多疾病，包括年龄相关性黄斑病变，视网膜静脉阻塞等多种疾病。近几年，周细胞成为抗血管生成靶点的研究热门。

大量的实验证明周细胞与新生血管的重要关系：(1)TGF-β可以不断地刺激细胞外基质形成和间充质细胞转化为血管周细胞，加固血管，防止新生血管渗漏，促进血管成熟。TGF-β基因敲除小鼠因血管不能分化重构、缺乏血管周细胞致其在胚胎时死亡[9]。(2)PDGF的缺失同样会导致胚胎鼠不能生成周细胞和血管平滑肌细胞，致使新生血管出现严重的渗漏，胚胎鼠妊娠晚期死亡[18]。(3)肿瘤组织中的周细胞为PDGF受体阳性细胞，使用PDGF受体抑制剂SU6668能够导致组织中的血管周细胞减少，明显抑制新生血管的生长、成熟[18]。

3.3 细胞外基质

细胞外基质同样是抑制血管生成的重要靶点，它的降解是新生血管生成必要条件。众多酶系可以有效降解细胞外基质，其中以MMPs系是最重要的一类，它能够维持细胞外基质动态平衡，基本上能够降解细胞外基质所有成分，促进新生血管形成[10]。目前在大鼠脉络膜新生血管模型中，MMPs抑制剂取得了理想的成果[19]。以此靶点治疗AS新生血管目前尚没有较为成熟的研究，有待于进一步探索。

4 目前存在的问题

既往AS斑块内的研究主要集中在血管内皮细胞方面，但一直没有突破性进展，此外以周细胞为靶点的实验性研究结果也不理想。而对于调控新生血管的另一靶点——细胞外基质的研究目前开展较少，间质微环境与AS斑块内发生的相互关系并未阐明，有待于进一步深入研究。AS斑块内间质微环境在新生血管中的研究现状，AS斑块内间质微环境成分包括：基质细胞、基底膜、细胞外基质、各种细胞因子及酶等。目前针对AS斑块内间质微环境的研究发现：AS斑块内大量血管生长相关因子被蛋白酶降解，导致VEGF缺失或失衡，进而使得周细胞募集受抑。这类降解细胞外基质最重要的蛋白酶同样有MMPs。MMPs为一组Zn2+依赖的蛋白水解酶，细胞外基质的降解平衡主要由MMPs和MMPs抑制系统控制，MMPs活性增强或MMPs抑制剂活性减低都会导致细胞外基质的降解和细胞外基质重塑，使内皮细胞迁移到外周形成新的微血管。Vempati等[20]发现MMPs单一的升高不能决定新生血管的形成，MMPs激活系统和抑制系统的不平衡才会导致新生血管增多。新生血管的生长、发展，降低了粥样斑块的稳定性[21]。大量研究已经证实：炎症细胞会大量分泌MMPs[22]。而其中被激活的MMP-1和MMP-10降解基底膜基质和Ⅰ胶原，破坏易损斑块表面的纤维帽，为炎性细胞的浸润提供良好的环境，极易引起组织的炎症性水肿[23]。2005年Martin等证明MMP-2表达存在双向性，既可以损伤组织，又可以修复组织。MMPs种类庞大，调控机制复杂，虽然研究较多，目前完全认识AS斑块的周围内环境仍旧很困难。

5 展望

对于新生血管间质微环境的研究在肿瘤方面已经取得了很大的成就，而在AS方面还有很多欠缺。通过调控新生血管间质微环境来防治AS是一种新的模式思维，已然成为现在研究的热门。目前，研究血管周围间质微环境对AS处于高速发展阶段，仍有许许多多的难题需要解决。AS斑块内微血管的形成，涉及到的调控机制较复杂、因子数目庞大，对其需要的技术及设备要求较高，还难以寻找到单一的、有效地控制斑块稳定的因子。

因此，如果能够深入研究新生血管间质微环境对AS斑块的影响，并且广泛应用在临床之前，能够充分认识并尽可能避免血管间质微环境改变对AS斑块的不良反应，将会使得治疗AS跨入新时代。

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