中性粒细胞胞外诱捕网在系统性红斑狼疮发病机制中作用的研究进展

林笑颖，周明倩，李海昌

(浙江中医药大学基础医学院，浙江 杭州 310053)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种经典的自身免疫性疾病，以大量自身抗体形成为主要特征，并导致全身多脏器及系统受累。SLE病因和发病机制尚不明确，最新研究[1]显示：中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)的形成过多及清除障碍可能参与SLE的发病机制，SLE患者体内的NETs水平与SLE活动度评分(SLE disease activity index,SLEDAI)呈正相关关系。

NETs自2004年被提出以来，已成为机体重要的防御方式，同时也是系统性自身免疫病发病机制中的主要参与者[2]。NETs以解聚的染色质作为骨架，上面镶嵌着核组蛋白、多种颗粒蛋白和某些胞浆蛋白，其中颗粒蛋白组分包括一级颗粒如弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、组织蛋白酶G、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和二级颗粒中的乳铁蛋白酶、抗菌肽 LL-37 及来源于三级颗粒的基质金属蛋白酶9(MMP-9)、肽聚糖识别蛋白等[3]。NETs所含的内容物及其与SLE之间的关系越来越受到关注。

1 NETs的形成

NETs形成作为新形式的细胞死亡过程被称为NETosis。形态学上，网捕死亡(NETosis)从核小叶消失开始，其次是染色质解链和核包膜分解成含有解链染色质的小囊泡，随后核囊泡和胞质颗粒的膜崩解，导致染色质与细胞质和颗粒内容物混合，最后质膜破裂，抗微生物颗粒蛋白质装饰的细胞质释放到细胞外空间如NETs中[4]。

NETs形成的机制和NETosis的亚细胞单位尚未完全被阐明，但NETosis的特征在于核膜分解，使染色质解链和基因组DNA暴露于活性氧(reactive oxygen species，ROS)。ROS在嗜中性粒细胞的活化及其细胞内容物的释放过程中起到调节作用。除烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)在吞噬体膜上的呼吸爆发途径产生ROS外，线粒体也是ROS生成的主要部位之一[5]，ROS的产生是NETs形成的早期关键步骤。此外，染色质解聚需要组蛋白转录后修饰转化成为瓜氨酸化组蛋白(citrullinated histone，citH)，这一过程依赖于肽酰基精氨酸脱亚氨酶(peptidylarginine deiminase，PAD)的催化[6]。PAD是5种钙依赖性酶的家族，其催化各种靶蛋白的瓜氨酸化过程，其中参与NETs形成的是PAD4。

2 NETs与SLE的直接关系

2.1 NETs是自身抗原的来源之一 NETs作为自身抗原可以诱导抗NET抗体的产生，如NETs形成过程中释放的DNA、颗粒蛋白和组蛋白等物质，可引发或加重SLE病情。同时，SLE患者体内由凋亡细胞等形成的循环微粒有增强NETosis作用[7]，其中在SLE患者体内异常升高的循环游离DNA(cfDNA)浓度与活动性狼疮肾炎有关[8]。Darrah 等[2]研究显示：已鉴定的NETs蛋白质中有84%为自身免疫病、癌症或两者共有的自身抗原，74% 蛋白质是自身免疫性疾病自身抗体的靶点。SLE患者外周血中死亡倾向的中性粒细胞数增加并伴随双链DNA抗体水平的增加，且与SLE的严重程度呈正相关关系，线粒体DNA(mtDNA)沉积在NETs中，SLE患者的抗mtDNA抗体水平升高，与干扰素(interferon，IFN)评分和疾病活动指数有密切关联[9]。SLE患者血清中中性粒细胞抗菌肽LL37与双链 DNA 所形成的免疫复合物(immune complexes，ICs)能作为自身抗原通过B细胞受体和Toll样受体-9活化B细胞，产生抗DNA抗体和抗菌肽LL37抗体，上述抗体均能在SLE患者体内被检出[10]。此外，在血浆中检测到的弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)主要来源于中性粒细胞释放的NETs，NE能够降解核心组织蛋白，暴露新的抗原表位，从而产生新的抗原，也是NETs引起自身抗体产生的原因之一。

在NETosis过程中有多种酶和活性氧修饰NETs内的蛋白质，如NE和组织蛋白酶。酪氨酸和色氨酸的氧化会改变细胞核内自身抗原的功能，这些修饰的蛋白可能会是自身免疫细胞的靶点。此外，释放的蛋白酶分解组蛋白氨基酸末端，暴露出自身抗原表位，产生自身抗体[11]。NETs中的组蛋白除了能产生抗组蛋白自身抗体外，Pieterse等[12]发现：乙酰化组蛋白和甲基化残留物的增加能通过增强NETs中抗菌肽的结合来间接增加NETs的免疫潜能，引起自身抗体的产生。而且，NETs中经修饰后的自身抗原有助于破坏易感宿主的免疫耐受性[13]。

2.2 SLE存在NETs清除缺陷 在正常条件下，单核源巨噬细胞可有效清除NETs，巨噬细胞吞噬后，NETs通过吞噬细胞穿梭到溶酶体中进行降解。由巨噬细胞摄取NETs不诱导促炎细胞因子分泌，因此免疫沉默[14]。

SLE患者体内的NETs增多，其主要原因如下：①NETs生成增多，SLE患者体内中性粒细胞增加，且有趋于NETosis的倾向；②NETs降解减少，SLE血清中存在抗NETs抗体，保护NETs免受脱氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribenuclease Ⅰ,DNase Ⅰ)作用，患者血清对NETs降解能力减弱、抗NETs抗体的存在及低DNase Ⅰ活性导致NETs的积累[15]。亦有研究[16]证明：NETs降解受损也与狼疮肾炎、低补体血症和自身抗体水平升高有关。

此外，62%SLE患者的血清中抗DNase抗体阳性，识别DNase催化位点附近保守表位的抗体可保护NETs免受降解，且SLE患者血清中抗DNaseⅠ和抗DNA抗体水平呈正相关关系，可能参与SLE的发病机制[17]。在“非降解物”的肾活检中，NETs上存在抗体沉积，表明ICs在肾脏内沉积，导致狼疮肾[18]。Leffler等[19]观察到：活动性SLE患者体中血清降解NETs的能力下降。补体C1q与NETs结合，激活补体经典途径，成为DNase Ⅰ抑制剂使NETs降解减少。NETs降解减少和激活的补体与NETs特异性自身抗体的存在有关，并可进一步放大炎症反应。NETs的低效降解也参与了自身抗体的产生，破坏了自我耐受，引起主要针对核自身抗原的自身免疫反应。自身抗原能诱发和增强自身抗体介导的局部炎症反应，并且在SLE或血管炎患者中持续诱导局部和全身炎症[20]。由此可知，异常数量的NETs产生自身抗原和自身抗体，并在SLE患者中产生持续损伤，直接参与SLE疾病的发生发展。

3 NETs与其他免疫细胞之间的关系

3.1 NETs能激活NOD(nucleotide-binding oligomerization domain)样受体家族3(NLRP3)炎性小体 NETs能刺激炎性小体，激活炎症通路。NLRP3炎性小体中的中枢酶caspase-1在SLE疾病发展过程中起着重要作用，NETs和抗菌肽 LL37可通过P2X7受体途径激活巨噬细胞中的caspase-1，产生大量的白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)，进一步促进炎性反应和NETosis，形成潜在的恶性炎性循环[21]；异常的炎性小体激活和IL-18的大量产生可损伤血管的修复功能，导致SLE患者出现心血管系统疾病；另外，IL-18还参与狼疮肾炎及皮肤病变的病理过程。

3.2 低密度粒细胞(low-density granulocyte，LDG)增加NETs形成 LDG是在SLE患者体内发现的一种异常促炎性嗜中性粒细胞亚群，表现出增强的自发性NETs。LDG分泌高水平促炎因子和α-干扰素(interferon-alpha，IFN-α)，对内皮细胞具有明显的毒性[22]，促进SLE的血管损伤[23]。IFN-α被认为是SLE发病机制的中枢介质，IFN-α能降低内皮修复能力导致SLE患者体内动脉粥样硬化保护机制受损[24]。尤其在未增加刺激的情况下，狼疮LDG被诱发持续地产生NETs，通过生成过多的NETs，LDG提高了自身抗原和免疫刺激分子的水平。

3.3 NETs杀伤内皮细胞促进血栓形成 异常的NETs形成能诱导内皮细胞损伤及增强血栓形成。SLE患者体内LDG诱导产生的NETs能够提高MMP-9水平，激活内皮MMP-2，从而诱导内皮细胞凋亡[25]。MMPs的循环水平与动脉粥样硬化事件的风险有关，而且高MMP-9水平与冠状动脉疾病进展和致命的心血管事件有关。在SLE患者体内MMP-9和抗MMP-9抗体组成的ICs能诱发NETs形成，并进一步加速血管病变。NETs中含有的高浓度血栓源性组织因子(tissue factor，TF)是静脉和动脉血栓形成的必要条件。中性粒细胞在内皮损伤的部位聚集，激活释放NETs，NETs诱捕血小板和红细胞，形成微血管血栓。

3.4 NETs促进浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)合成高水平IFN-α Garcia-Romo等[26]报道：与健康者比较，SLE患者的NETs能够激活pDC产生IFN-α、干扰素γ 诱导蛋白10(IFN-γ inducible protein 10，IP-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)。另外，Lande 等[10]证明：抗菌肽LL37除了能产生自身抗体，还能够保护DNA不被胞外物质降解，通过Toll样受体9(TLR9)和Toll样受体7(TLR7)活化pDC释放INF-α，INF-α进一步导致NETs形成增加，释放更多的LL37，形成恶性循环。由此可知，NETs激活pDC需要NETs中的抗菌肽。NETs的超乙酰化染色质激活骨髓和pDC并随后打破自我耐受，最终导致自身反应性T细胞和B细胞的激活，产生表征SLE的多种自身抗体。可见，SLE患者体内的NETs与NLRP3炎性小体和INF-α等相互作用形成病理性的反馈环路，揭示了NETs成为潜在治疗靶点的可能。

4 与NETs相关的SLE治疗潜在方向

针对NETs形成过程中关键的亚细胞事件或增强NETs清除率的药物可以为SLE及相关自身免疫性疾病提供新型治疗策略。潜在的治疗靶点包括以下几点。

4.1 增强NETs清除的靶点 NETs是由DNA骨架所构成，研究[19，27]显示：加入外源性的DNase Ⅰ不仅能恢复SLE患者受损NETs的降解功能，同时还发挥着抗血栓作用，降解损伤随着个体患者的疾病活动而变化。也有研究者[28]将重组DNase(rDNase)视为SLE治疗的潜在靶点。

4.2 抑制NETs生成的靶点 已知线粒体ROS能增强NETosis。研究[29]显示：使用线粒体ROS清除剂能消除LDG的NETosis以及自身免疫特征和临床表型。Van Avondt等[30]首次描述白细胞信号抑制受体1(SIRL-1)，一种带有ITIM的抑制性受体，通过消除MEK-ERK途径信号传导和抑制ROS形成来抑制NETs生成而成为治疗靶点。动物模型和人体的初步证据[31-32]表明：抑制PAD酶和其他嗜中性粒细胞相关靶标的靶向可有效预防NETs形成、减少与SLE相关的器官损伤，而且不会对治疗相关的感染性后遗症造成重大风险。抑制磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide3-kinases，PI3Ks)和相关酶的渥曼青霉素可以阻止空泡化和细胞内染色质解链，从而防止NETs形成和促进嗜中性粒细胞凋亡[33]。此外，生理浓度的抗疟药物是治疗SLE患者的主要药物，可以在体外抑制NETs形成[34]。维生素D与钙调神经磷酸酶抑制剂环孢素A可抑制NETosis，降低内皮损伤[35-36]。

综上所述，SLE患者体内异常数量的NETs，不仅是自身抗原的重要来源之一，还可刺激LDG、内皮细胞和pDC等细胞产生炎性因子，参与狼疮肾炎、皮肤病变和血管损伤等过程，加重SLE病情的发展。在SLE中NETs生成增多和降解受损的机制仍有待研究。因此，以NETosis和NETs组分作为靶点控制NETs的释放和清除有望成为临床治疗SLE的方向。