蓝舌病流行特点及诊断方法研究进展

董承帆，唐丽杰

（东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030）

蓝舌病(Bluetongue，BT)由蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的家养或野生反刍动物的一种典型的非接触性病毒性传染病。目前，这一疾病是 OIE划定的 A类疫病之一，我国已将其规定为一类动物传染病。该病自1905年被科学家Theiler确认以后，在世界各地均有发生，感染动物的死亡率高，疾病若不能被尽早发现将很难得到有效控制，因此，选择并建立有效的检测方法是控制本病的关键。

1 蓝舌病的流行特点

BTV是一种严重危害反刍动物的一类动物烈性传染病。BTV感染绵羊，主要危害羔羊。感染羊主要表现为发热、精神不振、食欲废绝，随着病程的进一步发展可见，口鼻部典型的“蓝舌”病变。BTV可经胎盘感染胎儿，引起流产、死胎或胎儿先天性异常，严重时可使整个羊群丧失一个产羔期的全部羔羊。BT主要通过媒介昆虫传播，因此当媒介昆虫盛行的季节，极易引起本病的发生。库蠓作为主要的传播媒介在传播疾病的过程中扮演着重要的角色。感染未发病的反刍动物，如牛、鹿等成为阴性携带者。

BTV在世界范围内分布和流行，已有流行的BTV可分为 26个血清型，且型与型之间无交叉保护作用。BTV因血清型的原因，需要针对特定血清型制定相应的解决办法。近年来，在瑞士和科威特的山羊和绵羊体内又分离到两个新的血清型BTV，分别为BTV-25和BTV-26。新的血清型的出现会使未免疫的易感动物感染而发病，甚至死亡，造成严重的经济损失，因此使用适宜的诊断方法对BTV进行检测至关重要。

2 蓝舌病的诊断方法

2.1 病原学检查

（1）病料采集 宜采全血(加2U肝素/mL)、动物病毒血症期的肝、脾、肾、淋巴结、精液(置冷藏容器保存，24h内送到实验检查处理)。

（2）直接镜检 取病羊的脾、细胞培养物或鸡胚组织制作超薄切片，负染后置电镜下观察，可发现球形，有双层蛋白外膜，直径55～70nm的蓝舌病病毒。

（3）分离培养 病毒培养在绵羊肾单层细胞上，48h左右出现细胞病变，几天内细胞全部感染，之后细胞脱落；感染非洲绿猴细胞后出现空斑，而抗病毒血清能够抑制空斑的形成。

（4）动物接种试验 采集病毒液经脑感染幼龄小鼠，6d左右出现致死性脑炎，将病毒液分别静脉或皮内接种易感羊和免疫羊，几天后易感羊出现典型的蓝舌病变，而免疫羊确无任何蓝舌病相关症状。

2.2 蓝舌病血清学检测方法

2.2.1 琼脂糖免疫扩散试验（AGID）

琼脂扩散试验为可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的半固体凝胶(琼脂或琼脂糖)中进行的一种沉淀试验。先将BTV用Vero或BHK-21进行扩增和培养，然后将所得的BTV抗原和待检血清加入到0.9%的琼脂糖凝胶中，分别设置阴性对照和阳性对照。该法的特点是在没有实验设备时，可以对大量血清样品进行检验。

2.2.2 血清中和实验（MTSN）

中和试验是利用同一病毒的不同型的毒株或不同型标准血清,即可测知相应血清或病毒的型。这个方法是将Vero或BHK-21细胞铺到96孔板中,待细胞的面积占孔面积的80%时,向96孔板中加入不同血清型的病毒，放到37℃ CO2培养箱中培养；与此同时，将待检血清进行灭活处理，然后按10倍连续稀释后加到培养板中，37℃温箱放置1h，试验结果若显示有1/4的孔中细胞发生病变则判定为BTV阳性血清。这个方法的不足是试验的准确性和所测定的效价会受到很多因素度影响，如：细胞培养的条件，培养液的成分，细胞类型等。

2.2.3 过氧化物酶染色法（IPS）

该方法是利用标记抗体来检测蛋白抗原，该方法主要包括：间接过氧化物酶检测法（IP）、荧光抗体检测法(FA)及过氧化物抗过氧化物酶检测法(PAP)等三种方法。其中敏感性最高的是IP中以抗生物素及生物素的复合物标记过氧化物酶为基础的ABC-IP检测方法，目前在生产实践中应用；其缺点是制备抗原蛋白和相应度抗体操作步骤多，而且易受外界影响因素的限制，无法长期保存的原材料。

2.2.4 酶联免疫吸附法（ELISA）

ELISA是指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。以重组VP7蛋白和抗VP7蛋白的McAb为基础的竞争ELISA方法作为OIE推荐的BTV血清学诊断方法已经商品化。这种方法在检测蓝舌病病毒群特异性抗原时，较间接ELISA、AGID等方法敏感。竞争 ELISA法以抗NS1蛋白单抗和抗VP7蛋白单抗作为检测用单抗，任何动物体内的蓝舌病抗体都可以被检测到。这一方法的优点是特异性高，即使样品中混有EHDV抗体，也不会有假阳性的结果出现。

2.3 蓝舌病分子生物学检测方法

2.3.1 PCR检测技术

PCR是聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。对于BTV这类RNA病毒需要先进行反转录，得到反转录产物cDNA后，以此为模板进行PCR扩增得到BTV片段。利用RT-PCR方法，具有灵敏度高，特异性强，产率高，重复性好，在感染早期病毒量少时适用于临床检测，但这一方法技术性强，而且比较耗时，需要实验仪器辅助，在基层较难推广。

2.3.2 核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术是利用不同来源的DNA单链与RNA链彼此有互补的碱基序列而结合来检测相应的病原核酸。在BTV核苷酸序列的检测中，设计BTV cDNA探针，利用其与BTV病毒RNA进行核酸杂交以检测BTV抗原。该方法的操作步骤较多，而且样品需要进行特殊处理，实验人员需要经过长期积累的操作经验才能掌握，并不适用于常规的病原检测。

3 结论

随着蓝舌病对养殖业危害的加剧，不仅仅是单独依靠疫苗来控制本病，发病初期的诊断也至关重要，目前有很多诊断方法可供我们选择，如病毒分离鉴定、血清学检测方法以及分子生物学检测方法。因地制宜，选择适合的诊断方法，制定全面有效的监测和控制措施将更有利于蓝舌病的综合防治工作。

[1]殷震,刘景华.1997.动物病毒学(第二版).北京:科学出版社,549-554.

[2]董长垣.现代分子病毒学[M].武汉:武汉大学出版，1996.

[3]Huismans H,et al.Characterization of the tubules associated with the replication of three different orbiviruses[J].Virology,1979,92(2):397-406.

[4]Maan S,et al.Complete genome Characterisation of a novel 26th bluetongue virus serotype from Kuwait[J].PLoS One,2011,6(10):26-47.

[5]Squire K R,et al.Detecting bluetongue virus RNA in cell culture by dot hybridization with a cloned genetic probe[J].J Virol Methods,1985,10(1):59-68.

[6]Ritter D G,et al.Genetic relationships of bluetongue virus serotypes isolated from different parts of the world[J].Virus Res,1988,11(1):33-47.

[7]Ismail I M.Bluetongue neutralization test with different Virus under variable conditions[J].Agr Res Rev,1987，65:867-872.