啤酒生产中的有害菌污染来源及相关检测

◎ 胡逸帆

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023）

啤酒生产中染菌的危险随时存在，所以必须进行广泛、有规律、持续不断的检测才能真正起到监控生产过程的微生物状况的目的。了解污染来源和染菌途径以及微生物通过何种途径进到企业生产中，并从哪儿进入生产过程。只要了解了污染来源和染菌途径，就可以采取针对性措施，防范污染，严格检查，以保障生产安全性和达到食品安全卫生标准。

1 污染来源及染菌途径

啤酒生产原料中带有大量微生物，大麦和麦芽带菌量可高达2×108个，主要通过灰尘扩散到周围空气中，再随空气进入敞口设备中。水也含有大量细菌，酿造水含菌量原则上说无意义，因为这些菌在麦汁煮沸时可以被杀死，重要的是生产用水、设备冲洗水、顶水等，它们直接与设备和啤酒接触。酒花因要煮沸，且对微生物有抑制作用，故基本无危险[1]。

空气自身带菌，由空瓶和原料扩散到空气中的菌，增加了空气的含菌量。空瓶带有大量的各种菌，卸瓶和运输进车间的过程中扩散到灌装车间，下料时原料上附着的灰尘连同微生物向周围环境中扩散。压缩空气同样也可带菌，特别是空气管道。空气除菌过滤器只是空气管道得到正确维护时的补充，无菌要求高的需使用空气干燥器，否则被抽进来的水气会一起被压缩进到地下室领域，而在地下室中水气低于露点会冷凝下来，潮湿的除菌过滤器会让微生物生存下来，特别危险的是麦汁通风、罐备压以及皇冠盖的压缩空气输送[2]。

接种酵母扩培过程中，保存和处理不当都有可能染菌，如长时间存放于酵母盆中会使酵母失去活力而容易染菌，每一步操作如筛洗酵母都会增加染菌的可能性，洗酵母和将酵母保存在水中不仅会夺走酵母的营养物质，而且如果水（管道、橡皮管）不是完全无菌也会导致染菌。设备污染主要是由于未清洗干净或清洗水带菌，密封圈以及密封圈下的凹槽是清洗的薄弱环节。硅藻土和稳定剂很少带菌，必要时需检查。瓶盖一般不会染菌，但也应定期检查。此外，在手工操作时，操作者的个人卫生及手的清洗杀菌也不容忽视[3]。

了解了污染来源和染菌途径，就可以有针对性地采取措施，防范污染，严格检查以保障生产的生物安全性和啤酒的生物稳定性。

2 啤酒生产麦汁、发酵液及酵母样的处理

2.1 各样品检测目的

实验室中的样品处理有2个目的：增殖和检查是否存在有害菌。在实际检测过程中，需根据所检测样品性质的不同采用不同的处理方法，再根据所检微生物的类型选择所需的培养基及培养方法。

2.1.1 培养基

麦汁琼脂培养基可检出酵母菌、营养琼脂培养基用于检出一般细菌，

NBB-A、NBB-B、NBB-C培养基可检出啤酒有害菌。

2.1.2 样品处理方法

（1）澄清液体样品。用0.45 μm过滤膜过滤。

（2）混浊液体样品。加入NBB-C培养基培养，加入量为空瓶总量的3%～5%。

（3）酵母。①直接镜检，检查污染程度、检查死亡率。②加入NBB-B培养基，增殖培养酵母样品。

其中，混浊液体样品和酵母样都可用于检查异类酵母，麦汁样可少量做膜过滤，滤膜可置异类酵母选择性培养基上，发酵液可先放冰箱静置让酵母沉降，然后倒掉上清液，底部沉淀同酵母样的处理。

2.2 材料的准备

生产麦汁、发酵液、酵母、NBB培养液、美蓝染色液、纯培养酵母、接种环、1 mL无菌吸管、5 mL无菌吸管、酒精灯以及超净工作台、恒温培养箱等。

2.3 麦汁的处理

取40 ml生产麦汁样置于50 mL取样瓶中，加入1～2菌耳纯培养酵母，装上发酵栓，于25～28 ℃发酵2 d，然后加入约2 mL NBB-C培养基，用无菌水装满取样瓶，装上发酵栓，25～28 ℃继续厌氧培养7 d。

2.4 发酵液的处理

取40 mL发酵液样置于50 mL取样瓶中，加入约2 mL NBB-C培养基，用无菌水填充取样瓶，装上发酵栓，25～28 ℃厌氧培养7 d。

2.5 酵母样的检测

①初步镜检。用接种环以无菌操作取酵母样并制片，在显微镜下观察是否有啤酒有害菌，并作记录。②酵母死亡率的检查。滴一滴美蓝染色液在载玻片上，用接种环取酵母样与美蓝染色液混合搅匀，制成切片，5 min后，在明场显微镜下数出被染成蓝色的酵母细胞数，计算出蓝色酵母细胞占总细胞的百分比，即死亡率。被染成蓝色的细胞即为死细胞。③增殖培养。用无菌吸管吸取1 mL稠酵母接入10 mL NBB-B培养基中，25～28 ℃有氧培养7 d。需要注意的是，取样后如不马上检验，需储存于1～5 ℃冰箱中，最长不超过20 h，4 h内使用较好，15 min内处理完毕最佳[4]。

3 压缩气体及室内空气的处理

3.1 材料

麦汁琼脂培养基、NBB琼脂培养基、营养琼脂培养基以及气体取样器等。

3.2 压缩气体

将麦汁琼脂培养平板、营养琼脂平板及NBB-A培养基平板对着压缩气体出口处吹2～5 min，也可用专用取样器取样，然后带回实验室。麦汁琼脂平板和营养琼脂平板上置于25～28 ℃培养箱中有氧培养2 d，NBB-A平板上置于25～28 ℃培养箱中厌氧培养5～7 d。

3.3 室内空气

将麦汁琼脂平板、营养琼脂平板、NBB-A培养基平板放在所需检查的车间，揭开培养皿盖，让培养基在空气中暴露30 min，然后盖上培养皿盖，带回实验室。麦汁琼脂平板和营养琼脂平板置于25～28 ℃培养箱中有氧培养2 d，NBB-A培养基平板置于25～28 ℃培养箱中厌氧培养5～7 d。

4 水样的处理

4.1 材料的准备

生产热水样、酿造水样、无菌生理盐水、无菌棉签、火枪、取样瓶、酒精、棉花、膜过滤装置、过滤膜、NBB-琼脂培养基、营养琼脂培养基以及麦汁琼脂培养基、超净工作台、恒温培养箱。

4.2 水样

取3个100 mL水样，用膜过滤方法处理，过滤后过滤膜分别置于NBB琼脂培养基，营养琼脂培养基和麦汁琼脂培养基上。NBB琼脂培养基置于25～28 ℃培养箱中厌氧培养5～7 d。营养琼脂和麦汁琼脂培养基置25～28 ℃培养箱中有氧培养1～2 d。

5 各样品培养结果鉴定

5.1 鉴定原理及方法

培养后有生长现象的样品，需做结果鉴定。对于使用一般细菌和酵母的基础培养基：数菌落数，看其是否符合标准。对于使用异类酵母选择性培养基的样品（表1检测），观察生长情况，结合微生物及宏观特征进行鉴定。

5.1.1 宏观特征

①是否产酸，对含指示剂的培养基观察颜色变化，NBB-琼脂培养基若有酸产生，颜色会由红变黄。对不含指示剂的培养基，测pH值。②是否有双乙酰气味或其他异味。③菌落形态特征（在固体培养基上）。

5.1.2 微观特征

对产酸和有繁殖现象的样品进行镜检，观察其菌落形态、细胞排列、暗视场显微镜中的折光性、运动性。

5.1.3 样品培养鉴定试验（拔丝实验、产气实验）

①氢氧化钾实验。从培养基上取出一耳菌待试验菌与一满耳菌5%KOH混合于载玻片上，继续搅动，如果形成粘稠液，抬起接种环有拉丝现象，说明被试验细菌为KOH阳性，为革兰氏阴性菌；如果搅动过程中无反应，说明被试验菌为KOH阴性，为革兰氏阳性菌。②过氧化氢实验。在待实验菌的菌落上滴一滴3%～5%过氧化氢溶液，若有气体产生，说明该菌为过氧化氢酶阳性，为需氧菌；若无反应，则说明该菌为过氧化氢酶阴性，为厌氧菌；若菌落太密集，可用接种环刮取一个待试验菌菌落置于载玻片上，滴加过氧化氢。该试验主要是为了区别需氧细菌与厌氧细菌，需氧菌具有过氧化氢酶，可将过氧化氢分解为水和氧气，厌氧菌不含过氧化氢酶，不能分解过氧化氢。

5.2 各样品取样结果

啤酒麦汁和发酵液测定结果表如表1、表2、表3。

表1 啤酒生产麦汁、发酵液测定结果表

表2 压缩空气及室内空气结果表

表3 水样检查结果表

6 讨论

对培养基上的微生物进行宏观、微观及试验观察，对照有害菌的性质特征，最后确定所检出的细菌的种类。需要指出的是，未检出结果只能说明在所处理的样品量内，在所用的培养基上，在所给定的培养时间内以及给定的培养环境中无微生物生长，不能说明其他问题。

以上为在啤酒日常微生物检测中的一些总结体会，啤酒生产中微生物对啤酒质量的影响至关重要，随着科学进步的发展，啤酒卫生相关检测将进一步大幅度的提高，以此来满足啤酒生产所需要达到的卫生标准[5]。