十一味益肾降糖方对2型糖尿病模型大鼠血糖及肾组织Wnt/β-catenin信号通路表达的影响

杨娜，刘丰林

开封市中医院，河南 开封 475001

糖尿病的病因多种多样，饮食不节、肾虚、情志失调均可导致发病，其病机核心以燥热为害，燥热耗损津液，水精代谢失调，气血循环阻滞，痰浊内生，体液暗耗而成消渴，基本病机是阴虚燥热[1]。中医药防治糖尿病有着悠久的历史，经过几千年的实践，积累了大量宝贵的经验，并逐渐形成了独特的学术体系[2]。在前人治疗糖尿病的基础上，依据辨证论治的原则，总结开发出十一味益肾降糖方，该制剂由黄芪、生地黄、白术、山茱萸、益母草、山药等中药组成，具有益气健脾、补肾降糖、利水消肿之功效，是开封市中医院的院内制剂，获得河南省食品药品监督管理局制剂批文(豫药制字Z04020164)，治疗糖尿病、肾病具有较好疗效[3]。本研究探讨十一味益肾降糖方对2型糖尿病(NIDDM)大鼠的降血糖作用以及对肾脏Wnt/β-catenin信号通路表达的影响，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠60只，雌雄各半，体质量(200±20)g，购自北京维通利华动物实验中心，许可证号：SCXK(京)2014-0016。在河南大学实验动物中心温度为(23±2)℃、湿度为(50±10)%、12 h光照交替的环境中饲养，动物实验通过动物伦理委员会的审批。

1.2 药品与试剂 十一味益肾降糖方由本院药剂科自制，浓缩成1.5 g生药/mL水煎剂的浓度。达格列净片(AstraZeneca公司)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司产品，批号：B64927)；糖化血红蛋白(HbA1c)测试盒(美国 Roche 公司)；胰岛素(FINS)酶联免疫(ELISA)法测试盒(瑞典 Mercodia 公司)；Wnt/βcatenin抗体(美国Abcam公司)；柠檬酸、柠檬酸三钠均购自天津化学试剂有限公司。

1.3 实验仪器 TBA-40FR(ACCUTE)全自动生化分析仪(日本东芝公司)；Microcl17微量离心机(美国Thermo公司)；Heraeus Biofuge Stratos冷冻离心机(德国Heraeus公司)；Power Wave 340酶联免疫检测仪(美国Bio-TeR公司)；雅培安妥超越型血糖仪(美国Abbott公司)及安妥超越血糖试纸。

1.4 模型的建立、分组及干预 60只SD大鼠随机均分为6组，即正常对照组、模型组、达格列净组与十一味益肾降糖方低、中、高剂量组，每组10只。大鼠适应性喂养1周后，除正常对照组给予普通颗粒饲料外，其余5组大鼠给予高糖高脂饲料，喂养4周后，禁食12 h后腹腔注射STZ 50 mg/kg，1周后空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L为模型复制成功[4]。达格列净组每天灌胃达格列净片1 mg/(kg·d)，十一味益肾降糖方低、中、高剂量组分别灌胃十一味益肾降糖方水煎液2、4、16 g/(kg·d)，正常对照组和模型组灌胃等量的生理盐水，每天给药1次，连续给药7周。给药期间正常对照组大鼠仍以普通颗粒饲料喂养，其余大鼠继续以高糖高脂饲料喂养。

1.5 指标的测定 分别于给药前及给药7周后，各组大鼠禁食12 h，取全血，4℃下3 000 r/min离心10 min，分离得血清和血浆，分别测定大鼠FBG水平、HbA1c水平和FINS水平，采用以下公式计算胰岛素抵抗指数(IRI)：IRI＝FBG×FINS/22.5。采用血糖仪和血糖试纸测定大鼠FBG水平；采用全自动生化分析仪，按照HbA1c测试盒说明书检测大鼠HbA1c水平；采用酶联免疫检测仪，按照FINS酶联免疫(ELISA)法测试盒说明书检测大鼠FINS水平。

1.6 Western blot法测定肾组织蛋白表达 取肾皮层组织以RIPA裂解液提取蛋白，再以Lowry法测定蛋白浓度。上述蛋白进行10%的SDS-PAGE电泳分离后，在200 mA条件下转移到PVDF膜上(2 h)，以5%的脱脂奶粉封闭液封闭1 h后，加入TBST稀释的一抗(Wnt4稀释比例为1∶1000；β-catenin稀释比例为1∶1000；内参β-actin稀释比例为1∶5000)，4℃摇床孵育过夜。再以荧光二抗(1∶5000)37℃摇床避光孵育1 h后洗膜，用红外激光扫描仪拍照并分析荧光条带的灰度值，以目的条带与β-actin灰度值的比值来表示蛋白表达量。显色后分析胶片中的Western blot荧光条带的灰度值[5]。

1.7 统计学方法 统计分析采用SPSS17.0统计软件，计量资料以(±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，组内前后比较采用配对t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG水平比较 见表1。与正常对照组比较，模型组大鼠FBG水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。给药后，与模型组比较，达格列净组、十一味益肾降糖方中、高剂量组大鼠FBG水平显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与给药前比较，达格列净组、十一味益肾降糖方高剂量组大鼠FBG水平显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠FBG水平比较(±s) mmol/L

表1 各组大鼠FBG水平比较(±s) mmol/L

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与给药前比较，③P＜0.05

组 别正常对照组模型组达格列净组十一味益肾降糖方低剂量组十一味益肾降糖方中剂量组十一味益肾降糖方高剂量组n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0给药前5.1 4±0.3 2 1 9.7 5±1.8 9 1 9.8 1±1.9 2 1 9.7 6±1.9 1 1 9.8 8±1.9 0 1 9.9 2±1.8 0给药后5.1 2±8.2 9 2 0.1 6±2.1 2①1 2.8 9±1.8 5②③1 8.3 8±2.1 3 1 7.9 3±1.9 2②1 6.3 8±1.8 9②③

2.2 各组大鼠HbA1c水平比较 见表2。与正常对照组比较，模型组大鼠HbA1c水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。给药后，与模型组比较，达格列净组、十一味益肾降糖方中、高剂量组大鼠HbA1c水平显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与给药前比较，达格列净组、十一味益肾降糖方中、高剂量组大鼠HbAlc水平显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠FINS、IRI水平比较 见表3。与正常对照组比较，模型组大鼠FINS水平升高，IRI升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。给药后，与模型组比较，达格列净组、十一味益肾降糖方中、高剂量组大鼠FINS水平降低，IRI显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与给药前比较，达格列净组、十一味益肾降糖方中、高剂量组大鼠FINS水平降低，IRI显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组大鼠HbA1c水平比较(±s)

表2 各组大鼠HbA1c水平比较(±s)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与给药前比较，③P＜0.05

组 别正常对照组模型组达格列净组十一味益肾降糖方低剂量组十一味益肾降糖方中剂量组十一味益肾降糖方高剂量组n H b A 1 c 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0给药前3.7 8±0.4 2 8.5 3±0.7 4 8.5 7±0.8 0 8.5 5±0.8 9 8.6 2±0.8 4 8.5 8±0.7 9给药后3.8 4±0.4 0 8.6 6±0.3 7①6.1 6±0.5 8②③8.2 3±0.3 9 7.6 7±0.4 0②③7.1 2±0.3 6②③

表3 各组大鼠FINS、IRI水平比较(±s)

表3 各组大鼠FINS、IRI水平比较(±s)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与给药前比较，③P＜0.05

组 别n F I N S(U/m L) I R I正常对照组模型组达格列净组十一味益肾降糖方低剂量组十一味益肾降糖方中剂量组十一味益肾降糖方高剂量组1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0给药前2.3 7±0.1 8 8.1 4±0.5 9 8.1 8±0.4 3 8.1 7±0.4 0 8.1 6±0.3 7 8.2 1±0.3 9给药后2.3 5±0.2 2 8.1 8±0.4 1①6.5 5±0.3 4②③8.0 4±0.3 4 7.3 7±0.4 3②③6.8 1±0.4 0②③给药前0.5 6±0.0 6 8.7 8±0.6 0 8.7 2±0.6 5 8.7 3±0.5 8 8.7 4±0.6 3 8.7 4±0.6 3给药后0.5 5±0.0 7 8.8 4±0.6 8①6.6 4±0.4 9②③8.3 5±0.6 2 7.7 8±0.5 5②③7.1 6±0.4 4②③

2.4 各组大鼠肾脏Wnt4、β-catenin蛋白表达比较见表4。与正常对照组比较，模型组大鼠Wnt4、β-catenin蛋白的表达量均明显增多，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，达格列净组、十一味益肾降糖方中、高剂量组大鼠Wnt4、β-catenin蛋白的表达量均明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

糖尿病是临床常见的内分泌代谢疾病，发病率仅次于肿瘤和心血管疾病，其病因和发病机制异常复杂，并发症多且严重，死亡率高。糖尿病是当前威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病之一，根据国际糖尿病联盟统计，2011年全球糖尿病患者人数已达3.7亿，其中80%在发展中国家，估计到2030年全球将有近5.5亿糖尿病患者[6]。

表4 各组大鼠肾脏Wnt4、β-catenin蛋白表达比较(±s)

表4 各组大鼠肾脏Wnt4、β-catenin蛋白表达比较(±s)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

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中医药是抗糖尿病药物开发的重要来源。已经有大量实验研究了中药或植物药以及其有效成分对糖尿病及相关并发症的治疗作用[2]。中医理论认为人的机体与环境密切相关，阴阳处于相对平衡状态，但饮食不节、肾虚和情志失调等因素可导致五脏虚弱、积热伤津、郁火伤阴和肾精亏损等，产生中医消渴的症状。中医药在治疗糖尿病方面具有药效温和，作用持久，缓解并发症的发生和发展，不良反应少，改善糖耐量等优点，作用机理表现出多靶点、多向性、多层面特点，具有不可比拟的优势，因此，从传统中医药中研究开发新型抗糖尿病中药制剂具有重要的意义和广阔的前景[7]。

糖尿病肾病发生时，伴随足细胞Wnt/β-catenin通路的激活、Wnt信号活化及β-catenin核易位表达的增加，该机制参与了肾细胞损伤的进展。在该通路中Wnt4蛋白对肾小管的形成及肾脏纤维化导致的肾小球硬化及损伤具有重要意义。β-catenin作为经典Wnt信号通路的核心蛋白，参与细胞代谢的增殖、分化和凋亡过程，具有介导细胞间黏附和参与基因表达的功能[8]。

十一味益肾降糖方是依据辨证论治的原则，通过长期实验筛选总结开发出的中药复方，该制剂由黄芪、生地黄、白术、山茱萸、益母草、山药等中药组成，具有益气健脾、补肾降糖、利水消肿之功效，方中黄芪、山药补中益气；生地黄、山茱萸止咳生津养阴。诸味药合用，可发挥健脾益气、清热养阴之功效。本研究发现，十一味益肾降糖方中、高剂量组可使2型糖尿病模型大鼠FBG和HbA1c水平与FINS、IRI降低(P＜0.05)，并具有一定的剂量依赖性。Wnt/β-catenin信号通路介导了糖尿病肾损伤动物模型的肾脏纤维化，作为细胞内重要的信号通路来调控系膜细胞功能。实验结果显示，模型组大鼠肾脏Wnt/β-catenin通路的表达明显升高，由此验证该通路的激活参与了2型糖尿病模型大鼠肾损伤的病程进展。十一味益肾降糖方可在一定程度上抑制大鼠肾脏Wnt/β-catenin通路的表达，对2型糖尿病所诱发的肾脏损伤具有一定的保护作用。

综上所述，十一味益肾降糖方具有降低2型糖尿病模型大鼠血糖的作用，并通过改善胰岛素抵抗、增加胰岛素敏感性产生一定的保护作用，具有一定的开发前景。

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