持续偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠菌群多样性、挥发性脂肪酸和血清脑肠肽的影响

常双双 马贵达 张敏红 石玉祥 冯京海

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2.河北工程大学农学院，邯郸 056021)

目前，关于高温环境对肉鸡影响的研究多集中在32 ℃以上[1]，而实际生产中低于32 ℃的偏热环境对肉鸡带来的影响也不容小觑，有研究表明偏热环境对肉鸡生理、行为、物质代谢、肠道菌群和生长性能等方面产生不利影响[2-4]。饲养密度同样是家禽养殖行业关注的焦点，它不仅直接影响肉鸡活动空间[5]，还间接影响鸡舍环境温度以及鸡只生长性能、行为、盲肠菌群及福利水平等[6-8]。研究表明短链脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)可降低肠道pH，达到促进益生菌的生长增殖并抑制特定病原菌定植的目的[9-11]。另外有研究表明肠道菌群与脑肠肽的分泌是相互作用的[12]，如双歧杆菌四联活菌片可显著升高血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)的含量，降低P物质(SP)的含量[13]。现已发现5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、VIP和SP等脑肠肽与胃肠活动相关[14]。但是目前针对偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠菌群、挥发性脂肪酸以及血清脑肠肽的影响研究尚未见报道，因此本试验旨在研究偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠菌群、挥发性脂肪酸以及血清脑肠肽的影响，以期为肉鸡科学的饲养管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

试验采用单因素设计，选取22日龄健康、体重相近爱拔益加(AA)肉鸡144只，随机分成3个组，每组6个重复，每个重复单笼饲养。将3个组的肉鸡转入环境温度为21 ℃、相对湿度为60%的环境控制舱适应7 d。29日龄时开始正式试验，单个鸡笼饲养面积为0.64 m2，饲养密度分别设置为每笼6只(公母各占1/2，Ⅰ组)、每笼8只(公母各占1/2，Ⅱ组)和每笼10只(公母各占1/2，Ⅲ组)，环境温度为31 ℃，相对湿度为60%，试验条件维持至试验结束，共计14 d。试验在动物营养学国家重点实验室环境控制舱内进行，温度、相对湿度自动控制(精度分别为±1 ℃和±7%)，无风，24 h光照。

1.2 试验饲粮

采用玉米-豆粕型饲粮，所用饲粮为参照NRC(1994)营养需要配制的粉状配合饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 饲养管理

试验肉鸡均采用单层平养，所选用笼具为本实验室研发的单层平养笼具[15]，自由采食与饮水，常规免疫。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 血液采集与指标测定

分别于试验第7天、第14天，每组随机选取6只肉鸡(公母各占1/2，每个重复1只肉鸡)，肉鸡采用静脉采血，静置2 h后，3 000 r/min低温离心10 min吸取血清，置于-80 ℃冰箱保存。

采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法测定血清中5-HT、VIP和SP的含量。

1.4.2 盲肠内容物的采集与指标测定

1.4.2.1 盲肠内容物的采集

分别于试验第7天、第14天，每组随机选取6只肉鸡(公母各占1/2，每个重复1只肉鸡)剪断颈静脉处死，全身消毒后剖开腹腔，分离肠道，结扎回盲交界处，剪下盲肠迅速移至超净工作台，用无菌剪刀剪开肠壁，收集盲肠内容物，将同一组的6个样品迅速混匀(用于挥发性脂肪酸测定的无需混匀)，装置于无菌离心管中，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

表1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础)

1)预混料为每千克饲粮提供 Premix provided the following per kg of the diet:VA 10 000 IU,VD33 400 IU，VE 16 IU，VK32.0 mg，VB12.0 mg，VB26.4 mg，VB62.0 mg，VB120.012 mg，泛酸钙 pantothenic acid calcium 10 mg，烟酸 nicotinic acid 26 mg，叶酸 folic acid 1 mg，生物素 biotin 0.1 mg，胆碱 choline 500 mg，Zn (ZnSO4·7H2O) 40 mg，Fe (FeSO4·7H2O) 80 mg,Cu (CuSO4·5H2O) 8 mg,Mn (MnSO4·H2O) 80 mg，I (KI) 0.35 mg，Se (Na2SeO3) 0.15 mg。

2)计算值 Calculated values。

1.4.2.2 挥发性脂肪酸含量测定

称取2 g左右盲肠食糜置于离心管中，然后准确加入5 mL超纯水，旋涡振荡3～5 min，5 000×g离心10 min；取上清液1 mL置于塑料安培管中，加入0.2 mL的25%偏磷酸溶液，盖紧盖子，振荡摇匀，并置冰水浴中30 min；10 000×g离心10 min，取上清液，上机测定盲肠内容物中乙酸、丙酸和丁酸的含量。

1.4.2.3 DNA的提取

采用Fast DNATMSPIN Kit For Soil提取样品基因组DNA。

1.4.2.4 细菌16S rDNA片段的PCR扩增

以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F和518R扩增样品16S rDNA高变区序列，引物信息见表2。

表2 引物信息

PCR扩增体系(50 μL)为：10×PCR buffer 5 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3.2 μL；ExTaq(5 U/μL)0.4 μL；GC-338F(20 μmol/L)1 μL；518R(20 μmol/L)1 μL；模板DNA 50 ng；补ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最终72 ℃延伸10 min。PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收。PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient，凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统。

1.4.2.5 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析

取10 μL PCR的产物进行DGGE分析。采用变性梯度为35%～55%、浓度为7%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中150 V、60 ℃下电泳5 h。DGGE完毕后，采用银染法染色，步骤如下：1)固定液(乙醇50 mL、冰醋酸2.5 mL，定容至500 mL)固定15 min；2)Milli-Q纯水清洗20 s和2 min各1次；3)银染液(硝酸银1 g、37%甲醛0.75 mL，定容至500 mL)染色15 min；4)Milli-Q纯水清洗20 s和2 min各1次；5)显色液(氢氧化钠7.5 g、37%甲醛2.5 mL，定容至500 mL)显色5～7 min；6)最后用终止液(乙醇50 mL、冰醋酸2.5 mL，定容至500 mL)终止反应。

1.4.2.6 DGGE图谱中优势电泳条带的序列测定

DGGE凝胶条带回收后，以338F/518R为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆测序。测序结果与GenBank中的序列进行比对，得到条带所代表的细菌类型。每个回收条带选取3个克隆进行序列测定。

1.5 数据处理

试验数据使用SAS 9.2统计分析软件进行单因素分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著；采用软件Quantity One分析DGGE图谱多样性。

2 结果与分析

2.1 肉鸡盲肠菌群多样性

2.1.1 肉鸡盲肠菌群PCR-DGGE扩增指纹图谱分析

由图1和图2可知，试验第7天和第14天，偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠菌群条带数产生影响，且Ⅱ组肉鸡盲肠菌群条带数高于Ⅰ组和Ⅲ组。由表3可知，同一阶段，偏热环境下不同饲养密度间肉鸡盲肠菌群相似性指数为44.3%～61.0%，其中Ⅰ组和Ⅱ组间盲肠菌群相似性最低仅为44.3%，Ⅱ组和Ⅲ组间盲肠菌群结构相似性最高仅为61.0%，这表明偏热环境下Ⅱ组肉鸡盲肠菌群丰富度最高，此外Ⅱ组与Ⅰ组间比Ⅲ组与Ⅰ组间盲肠菌群相似性低，即Ⅱ组与Ⅰ组间比Ⅲ组与Ⅰ组间盲肠菌群结构差异大。

2.1.2 肉鸡盲肠菌群结构多样性分析

由表4可知，偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠菌群结构多样性产生一定的影响。试验第7天，Ⅰ组肉鸡盲肠菌群香农指数和辛普森指数分别为2.20和0.88，Ⅱ组分别为2.36和0.90，Ⅲ组分别为2.12和0.87。试验第14天，Ⅰ组肉鸡盲肠菌群香农指数和辛普森指数分别为2.59和0.92，Ⅱ组分别为2.70和0.93，Ⅲ组分别为2.57和0.92。由此可见，偏热环境下Ⅱ组肉鸡盲肠菌群多样性高于其他2个组。

2.1.3 肉鸡盲肠特异性菌群和共性菌群分析

从肉鸡盲肠菌群16S rDNA V3区PCR-DGGE指纹图谱中分别割胶回收了1条特异性条带和4条共性条带，由图1和表5可知，试验第7天和第14天3个组肉鸡盲肠内容物中均检测出共性条带2号菌条带[单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)]、3号菌条带(Eisenbergiellamassiliensis)、4号菌条带(Clostridiumstraminisolvens)和5号菌条带(Ruminococcusfaecis)，仅Ⅱ组肉鸡盲肠内容物中检测出1号菌条带[普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)]。

图谱左侧条带编号2、5和6分别为试验第7天Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅰ组，图谱右侧条带编号2、5和6分别为试验第14天Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅰ组。

The left band numbered 2, 5, 6 were groups Ⅱ, Ⅲ and Ⅰ on the 7thday of the experiment, and the right band numbered 2, 5, 6 were groups Ⅱ, Ⅲ and Ⅰ on the 14thday of the experiment, respectively.

图1肉鸡盲肠内容物菌群DGGE图谱

Fig.1 DGGE profiles of microflora in cecal contents of broilers

图2 3个组间盲肠菌群条带数比较

在5个测序结果中，条带序列大部分分布于厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)，与GenBank数据库中细菌的相似度均在92%以上。

2.2 肉鸡盲肠挥发性脂肪酸含量

由表6可知，试验第7天和第14天，偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)含量的影响无显著差异(P>0.05)。

2.3 肉鸡血清脑肠肽含量

由表7可知，试验第7天，偏热环境下Ⅱ组肉鸡血清5-HT含量显著高于Ⅰ组(P<0.05)，而偏热环境下饲养密度对肉鸡血清VIP和SP含量的影响无显著差异(P>0.05)；试验第14天，偏热环境下饲养密度对肉鸡血清5-HT、VIP和SP含量的影响无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠菌群多样性的影响

肠道菌群是肉鸡体内环境中不可缺少的组成部分，在平衡状态时，对其宿主是有益无害的[16]。而家禽在生长发育过程中，环境应激可改变家禽肠道菌群结构[17]。研究报道，持续偏热环境(26和31 ℃)下肉鸡盲肠细菌条带数和菌群多样性下降[4]；在3周龄时饲养密度显著影响肉鸡消化道菌群变化，变化最显著的是嗉囊和盲肠菌群(相似性分析的R值分别为0.77和0.69，P≤0.05)；6周龄时饲养密度对嗉囊和盲肠菌群的影响存在显著差异(相似性分析的R值分别为0.52和0.27，P≤0.05)[18]。本试验研究表明偏热环境下Ⅱ组肉鸡盲肠菌群丰富度和相似性高于其他2个组，进而说明偏热环境下0.64 m2饲养8只鸡的饲养密度有利于肉鸡盲肠菌群的生长。

研究表明，肉鸡盲肠内主要以厚壁菌门为主，其次为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门[19-20]。随着饲养密度增加，即饲养密度高于450 cm2/只时，笼养蛋鸡十二指肠中有益菌(Lactobacillusgastricus和Lactobacillusalvi)消失，并对肠道菌群平衡产生不利影响[21]。本试验研究发现，Ⅱ组肉鸡盲肠中检测出特异性菌群Bacteroidesvulgatus，而另外2个组并未发现。Bacteroidesvulgatus属于拟杆菌门，拟杆菌门是肠道革兰氏阴性菌中数量最大的一类细菌，产降解植物细胞壁的酶，参与植物细胞壁的降解，从而与肠道的消化功能有关[4]。

表3 戴斯系数比较PCR-DGGE图谱的相似性

表4 肉鸡盲肠菌群结构多样性分析

表5 DGGE图谱中条带的基因片段序列比对

3.2 偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠挥发性脂肪酸含量的影响

SCFA是肠道菌群的主要代谢产物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，是由纤维和抗性淀粉(指在小肠中难以被消化的淀粉及其降解产物)在肠道中经厌氧菌发酵产生[22]。SCFA可降低肠道pH达到促进益生菌生长增殖并抑制特定病原菌定植的目的[9-11]。另有研究表明，肠道菌群以SCFA为介质作用于肠嗜铬细胞，影响肠道重要信息分子5-HT的合成和释放[23]。而本试验研究发现，偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠挥发性脂肪酸含量的影响无显著差异。

表6 肉鸡盲肠挥发性脂肪酸含量

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表7 肉鸡血清脑肠肽含量

3.3 偏热环境下饲养密度对肉鸡血清脑肠肽含量的影响

脑肠肽可以直接作用于中枢神经系统，由血液所携带的脑肠肽是胃肠道向脑内传递的重要化学信号，这些信号物质可以通过脑干的最后区直接入脑而作用于脑干迷走复合体，进而影响迷走神经的传出功能，参与胃肠运动、食欲及摄食功能的调节[24]。

5-HT又名血清素(serotonin)，是一种神经递质，也是重要的肠道生理调节器，主要由肠内分泌细胞产生，参与调解肠道运动和感觉，直接或间接刺激肠道分泌。研究报道，在生命早期缺乏菌群的时候，会导致血浆色氨酸水平的升高[25]。还有研究表明双歧杆菌则可以影响色氨酸的代谢，口服婴儿双歧杆菌可诱导大鼠神经递质多巴胺、5-HT血浆浓度升高[26]。VIP是一种非胆碱能非肾上腺素能抑制系统的神经递质，对胃肠活动起抑制性调节作用，引起全胃肠环形肌松弛[27]，还能改善肠黏膜组织微循环及内环境，为肠上皮细胞提供营养物质和氧，并清除过多的氧自由基等有害物质[28]，减少脂多糖对肠黏膜的损伤，促进有益菌的定植使菌群比例恢复正常[29]。SP本身又是一种速激肽，可增加胃肠蠕动，强烈促消化道平滑肌收缩，加强结肠的集团推进运动，刺激小肠、结肠黏膜分泌水和电解质，使胃肠道的血管扩张，通透性增高，血浆外渗，并参与炎症过程和免疫反应[30]。

本试验研究发现，偏热环境下Ⅱ组肉鸡血清5-HT含量显著高于Ⅰ组，而偏热环境下饲养密度对肉鸡血清VIP和SP含量的影响无显著差异，这可能与肉鸡肠道菌群的变化相关，有待进一步试验探究。

综上所述，偏热环境下饲养密度可改变肉鸡盲肠菌群多样性与结构以及血清脑肠肽5-HT的含量，但不影响盲肠挥发性脂肪酸的含量，各检测指标间的确切关系有待进一步探究。

4 结 论

① 偏热环境下Ⅱ组肉鸡盲肠菌群丰富度和多样性高于Ⅰ组和Ⅲ组，同时该组饲养密度有利于盲肠Bacteroidesvulgatus的定植。

② 偏热环境下饲养密度对肉鸡盲肠挥发性脂肪酸含量的影响无显著差异。

③ Ⅱ组肉鸡血清5-HT含量显著高于Ⅰ组，但偏热环境下饲养密度对血清VIP和SP含量的影响无显著差异。

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