基于液体培养基的白芨种苗离体快繁技术

熊丙全+廖相建+郑雪莲

摘要：针对白芨[Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.]种苗人工繁育存在的问题，介绍了一种基于液体培养基的白芨种苗离体快繁技术，比较了不同成熟度白芨种子离体培养的具体技术方案。该技术操作简便，成本低廉，能有效实现白芨组培苗的高效快速生产，适宜于进行规模化生产。

关键词：白芨[Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.]；组织培养苗；液体培养基；离体快繁

中图分类号：S567.23+9.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）02-0080-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.020

Abstract： A rapid in vitro propagation technique based on liquid culture medium for artificial breeding of Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f. seedling was introduced aiming at solving the current problems. The specific techniques for in vitro culture of B. striata seeds with different maturity were compared. As practice confirms， the technique was with simple operation and low cost， which can effectively realize the rapid and efficient production of B. striata tissue culture seedling， thus was suitable for large scale production.

Key words： Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.； tissue culture seedling； liquid culture medium； in vitro rapid propagation

白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]为兰科（Orchidaceae）白芨属（Bletilla Reichb.f.）多年生宿根草本植物，根呈白色，数个相连，故名白芨，别名白及、连及草、甘根。白芨花大色艳，具有较高的观赏价值；同时白芨生有肥厚的肉质块状假鳞茎，是重要的中药材之一，具有收敛止血、消肿生肌的功效。随着白芨的持续开发，市场需求连年增长，价格逐渐上涨，致使野生资源私挖滥采严重，导致白芨野生资源濒临枯竭，现有的白芨资源受到严重破坏，已无法满足市场需求，因而也被国家列为重点保护野生药用植物之一[1]。在自然野生状态下，成熟的白芨种子呈粉末状，非常细小，开花授粉15周后的种子有胚率仅为59%左右，很少萌发成苗[2]，因此其种子自然萌发率极低，繁殖困难。目前人工繁育多采用分株繁殖，即将块茎切成小块种植，但繁殖系数低、消耗量大、大面积供种依然较为困难，难以满足大规模生产的需求[3，4]。采取植物组织培养技术，可在短时间内获得大量的白芨实生苗，是一种快速有效的繁殖方法，目前主要通过将种子撒播在添加激素的固体培养基上萌发，再生出无菌苗，或诱导原球茎、经增殖生根后进行快繁[4]，这要涉及4～5种以上的培养基，操作较为繁琐，且周期较长，最短在110 d内方能成苗移栽，相对生产成本较高[5，6]。为此课题组探讨了一种基于液体培养基的白芨种苗离体快繁技术，该技术选用液体培养基，用液体悬浮培养萌发种子，而不是常用的固体培养基表面萌发，其能有效地提高白芨种子萌发率，缩短白芨成苗时间，快速获得白芨幼苗，下面将该技术介绍如下。

1 未成熟白芨种子离体培养

1.1 种子表面灭菌及萌发

选取开花授粉15周后、未开裂的白芨蒴果（含种子），在成都农业科技職业学院园林园艺分院实验室超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30 s，去离子水冲洗1～2次。用解剖刀及镊子仔细剥开果实，将种子小心地抖落到无菌组织培养瓶中，加适量5%的次氯酸钠溶液（滴加1～2滴吐温-20）消毒20 min。用灭菌的50目细胞筛过滤种子；再用去离子水冲洗、过滤，反复4～6次，冲去表面残留的消毒液。将细胞筛上过滤的种子以MS+1.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的种子萌发液体培养基冲洗到三角瓶内，于25 ℃、100 r/min黑暗培养15-20 d。通常培养5 d后，种子即可萌发，此时转入16 h/8 h的光周期环境下光照培养，一般接种15 d后种子发育形成叶片。

1.2 种子生长成芽

将接种15 d、已萌发的白芨种子经50目细胞筛滤去液体，把种子原球茎接种于MS+0.2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂、pH 5.8的固体诱导成芽培养基上，尽量分散幼苗，每皿约100粒，于25 ℃、16 h/8 h光周期培养。一般培养30 d后，当幼芽生长为幼苗，约2 cm左右、根长约0.5 cm左右时即可进行生根培养。

1.3 生根培养

将平皿中的白芨幼苗接种到1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+2 g/L活性炭+6 g/L琼脂、pH 5.8的固体生根培养基上，每瓶接种25～30株，于25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养，促进幼苗和根的生长，提高壮苗生根率。生根培养30 d后，组培苗生长为健壮的成苗，形态见图1。

1.4 炼苗移栽

当白芨幼苗的根生长到3～5 cm时（一般在白芨种子萌发后75-90 d）即可炼苗移栽，栽前先逐渐揭开瓶盖适应3-5 d外界环境，期间注意保持瓶内湿度。移栽时用清水洗净根部琼脂，避免损伤根及原球茎；将健壮的白芨组培苗移栽到装好育苗基质的穴盘中，选蔬菜或花卉育苗基质即可，栽后基质浇透水，于炼苗棚中培养。棚中前期注意弱光保湿，第一周应覆盖遮阳网保持弱光，并覆盖薄膜保湿；移栽15 d后白芨成苗即生长正常，移栽30 d左右即可定植，定植后常规田间管理，移栽情况见图2。白芨移栽存活的关键是原球茎的大小及活力，一般有原球茎的幼苗均能移栽存活，存活率可达95%以上。endprint

2 近成熟白芨種子离体培养

2.1 种子表面灭菌及萌发

将开花后20周以上、近成熟的白芨蒴果（未开裂，含种子）用纱布包好，自来水流水冲洗30 min，再在超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30 s，无菌水冲洗1～2次，用解剖刀及镊子小心剥开果实，将种子小心拨入无菌组培瓶中，加适量5%次氯酸钠溶液（滴加2～3滴吐温-20）消毒20 min。用灭菌的细胞筛（50目）过滤种子；再用去离子水冲洗、过滤，反复4～6次，冲去表面残留的消毒液。将细胞筛（50目）上过滤的种子，用MS+2.0 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的种子萌发液体培养基冲洗到三角瓶内。25 ℃、100 r/min、黑暗培养15 d。

2.2 种子生长成芽

已萌发的种子经细胞筛（50目）滤去液体，将种子原球茎接种于MS+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂、pH 5.8的诱导成芽固体培养基上，尽量分散种子，每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养20-30 d。

2.3 生根培养

将生成的幼苗及增殖的幼苗接种到1/2 MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+0.5 g/L活性炭+6 g/L琼脂、pH 5.8的生根培养基里，每瓶25～30株，25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养30-40 d。

2.4 炼苗移栽

当白芨幼苗的根生长到3～5 cm长时，即可炼苗移栽，栽前先揭开瓶盖适应外界环境3-5 d。移栽时先用清水洗净根部琼脂，注意不要损伤根及原球茎结构；将健壮的白芨组培苗移栽到装有育苗基质的穴盘中，栽后浇透水，于炼苗棚中继续培养。管理上前期注意弱光保湿，第一周应加盖遮阳网保持弱光，并覆盖薄膜保湿；移栽15 d后白芨成苗即可生长正常，移栽30 d左右即可定植；定植后常规田间管理。

3 成熟白芨种子离体培养

3.1 种子表面灭菌及萌发

将成熟的白芨蒴果（未开裂，含种子）用纱布包好，自来水流水冲洗30 min；在超净工作台上用75%乙醇进行表面消毒30 s，无菌水冲洗1～2次，用解剖刀及镊子小心剥开果实，将种子小心拨入无菌组培瓶中，加适量5%次氯酸钠溶液（滴加2～3滴吐温-20）消毒20 min。将细胞筛（50目）上过滤的种子用MS+0.5 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖、pH 5.8的种子萌发液体培养基冲洗到三角瓶内。25 ℃、100 r/min黑暗培养15 d，萌发率达99%。

3.2 种子生长成芽

已萌发的种子经细胞筛（50目）滤去液体，将种子原球茎接种于MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂、pH 5.8的诱导成芽固体培养基上，每皿100粒。25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养20-30 d。

3.3 生根培养

将长大的幼苗及增殖的幼苗接种到1/2 MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1.0 g/L活性炭+6 g/L琼脂、pH 5.8的生根培养基上，每瓶25～30株，25 ℃、16 h/8 h光周期环境里培养30-40 d。

3.4 炼苗移栽

当培养出的白芨幼苗根生长到3～5 cm长时，炼苗移栽，栽前先揭开瓶盖适应自然条件3-5 d。移栽先时用自来水洗净根部附着的琼脂，小心不要损伤根及原球茎结构；将健壮的白芨组培苗移栽到装有基质的育苗穴盘中，栽后浇透水，于炼苗棚中放置整齐，继续炼苗培养。管理上前期注意弱光保湿，第一周应加盖遮阳网保持弱光，并覆盖薄膜保湿；移栽15 d后白芨成苗即可生长正常，移栽30 d左右即可定植；定植后常规田间管理。

4 小结

采用近成熟的白芨种子进行液体悬浮培养，能显著提高种子萌发率，可达99%，并加快原球茎的生成速度（15 d左右）。且该技术操作简便，成本低廉，每瓶液体培养基可萌发数万粒种子，且种子萌发整齐，出苗一致，污染率低，结合简化的固体培养基培养，大大缩短了白芨组织培养周期，最快能在75～90 d内获得大量健壮的无菌苗用于移栽，实现了白芨组培苗的高效快速生产，并有效简化了操作程序，降低了生产成本，便于规模化生产。

参考文献：

[1] 张红岩，席刚俊，徐 超.关于白芨在江苏省的发展前景[J].农技服务，2015，32（7）：121，120.

[2] 张亦诚.白芨的生物特性及栽培技术[J].农业科技与信息，2007（11）：45.

[3] 石 晶.白芨属植物资源与利用[D].海口：海南大学，2010.

[4] 朱虹娴，马美兰，戚正华，等.白芨无菌播种快繁体系的建立[J]. 浙江农业科学，2015，56（9）：1409-1410.

[5] 袁 宁，何俊蓉，何 锐，等.白芨组培快繁育苗技术研究[J].西南农业学报，2009，22（3）：781-785.

[6] 房慧勇，李旻辉，尧建勋，等.应用正交实验法研究濒危中药白及成苗因子[J].医学研究与教育，2012，29（4）：74-78.endprint