狼毒粉、狼毒大枣汤的单次给药毒性研究

马立威+樊丽+倪世宇

[摘要] 目的 研究狼毒粉（EFSP）、狼毒大枣汤（DEFSJ）的单次给药毒性反应，为安全用药提供参考。 方法 分别制备EFSP、DEFSJ，采用改良寇式法测定其半数致死量（LD50）及其95%可信度；并通过检测小鼠血液生化学和组织病理学检查评价其对小鼠肝、肾功能的影响。 结果 EFSP的LD50为2.12 g/kg，95%可信限为1.61～2.78 g/kg，DEFSJ的LD50为12.60 g/kg，95%可信限为9.65～16.48 g/kg。EFSP、DEFSJ给药组与枣汤组比较，随着给药剂量的增加，体重呈显著降低趋势，但脏器系数变化不明显；小鼠血液生化学结果显示，血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平均升高（P < 0.05），肌酐、血尿素氮水平有升高的趋势；病理学检查结果显示，两药对小鼠的肝、肾功能有一定的损伤。 结论 EFSP、DEFSJ均有一定的肝、肾毒性。

[关键词] 狼毒粉；狼毒大枣汤；改良寇式法；单次给药毒性

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（b）-0004-06

[Abstract] Objective To study single drug toxicity of Euphorbia fischeriana Steud Powder （EFSP） and Decoction of Compatibility of Euphorbia fischeriana Steud and Jujubae （DEFSJ） and provide a reference for safe medication. Methods Modified Karber method was adopted to detect lethal dose 50 （LD50） and the 95% confidence interval of EFSP and DEFSJ. Blood biochemistry and histopathology were detected to evaluate the toxicity of EFSP and DEFSJ on liver and kidney of mice. Results The LD50 of EFSP was 2.12 g/kg， and the average 95% confidence interval was 1.61-2.78 g/kg. The LD50 of DEFSJ was 12.60 g/kg， and the average 95% confidence interval was 9.65-16.48 g/kg. Compared with the Jujubae Decoction group， as the dosage was increased， the mice weight was significantly decreased， however， organ coefficient was not obviously changed in EFSP and DEFSJ groups. The blood biochemical results showed that the levels of alanine transaminase and aspartate transaminase were elevated （P < 0.05）， and the levels of creatinine and blood urea nitrogen had an increased tendency. Pathological changes of kidney and liver were found by histopathological examination. Conclusion Both EFSP and DEFSJ have definite toxicity on kidney and liver.

[Key words] Euphorbia fischeriana Steud Powder； Decoction of Compatibility of Euphorbia fischeriana Steud and Jujubae； Modified Karber methods； Single dose toxicity

狼毒粉（EFSP）中的狼毒為大戟科植物狼毒大戟的干燥根；狼毒大戟是中药狼毒的主流产品；狼毒大戟主要分布于东北、河北和河南等省区，资源丰富，药源充足。狼毒大戟始载于《神农本草经》，因其具有散结、逐水、止痛、杀虫等功能，临床用于治疗肿瘤、结核病和皮肤病等，在民间兼用作植物杀虫剂，用于防治螟虫、蚜虫、地蛆等[1-2]。狼毒大枣汤（DEFSJ）为中药狼毒大戟和大枣按一定比例混合，经浸泡、煎煮、浓缩后制成的汤剂；民间有偏方用狼毒蒸大枣，食其枣来治疗实体瘤，但目前尚没有这方面的文献报道；有报道[3]，自制DEFSJ临床应用治疗关节炎、黄水、银屑病、淋巴腺结核等；关于其毒性，也有文献报道，患者服用其治疗银屑病出现中毒的现象[4]。本文以EFSP、DEFSJ为研究药物，观察其对小鼠的单次给药毒性作用，为其进一步的临床开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

大枣（陕西绿音狗头枣）；狼毒大戟（道地药材，采于黑龙江省泰康县）；谷丙转氨酶（ALT）试剂盒（罗氏，REF 20764957，LOT 621149-01）；谷草转氨酶（AST）试剂盒（罗氏，REF 20764949，LOT 618503-01）；肌酐（Cr）试剂盒（罗氏，REF 03263991，LOT 617550-01）；尿素氮（BUN）试剂盒（罗氏，REF 04460715，LOT 120125-01）；SPF级鼠粮及垫料（北京科奥协力饲料有限公司）。endprint

1.2 实验仪器

R-220型旋转蒸发仪（瑞士，BUCHI公司）；NLD-6DJ型细胞破壁机（中国，济南纳力德超微粉碎技术有限公司）；cobasc311型全自动生化分析仪（瑞士，罗氏）；AL204型电子天平（德国，梅特勒-托利多公司）；BXF53型显微镜（日本，OLYMPUS）；VIP5型全自动组织脱水机（日本，樱花医疗科技有限公司）；TEC5型组织包埋机（日本，樱花医疗科技有限公司）。

1.3 实验动物

昆明种小鼠，饲养室环境温度控制在（22±3）℃，相对湿度60%，12 h光暗周期，小鼠饲养按照SPF动物饲养规范进行，4～5周龄，雌雄各半，体重18～22 g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，生产许可证：SCXK（黑）2013-001，饲养于齐齐哈尔医学院实验动物中心，饲养许可证：SYXK（黑）2016-001，适应性喂养3 d后进行实验。

1.4 实验方法

1.4.1 实验药物的制备

1.4.1.1 枣汤的制备 取大枣1 kg，加水10 L浸泡，煎煮，过滤后，旋转蒸发仪浓缩，得浓缩液2 L。

1.4.1.2 EFSP的制备 取狼毒大戟干燥根若干，粉碎后经细胞破壁机打成超微粉，称取超微粉10 g，以枣汤为溶剂溶解，加100 mL枣汤，相当生药量为0.1 g/mL，混合均匀后，备用。

1.4.1.3 DEFSJ的制备 取新鲜狼毒若干，与大枣和蒸馏水按照质量比1∶1∶10的比例混合，取狼毒1 kg，大枣1 kg，加水10 L，浸泡30 min，煎煮2 h/次，共煎煮2次，过滤后，旋转蒸发浓缩2 L后，備用（参照EFSP制备，枣汤相当溶剂，生药量为0.5 g/mL）。

1.4.2 单次给药毒性预实验

取小鼠若干只，雌雄各半，禁食12 h，不禁水，按照药理学实验方法[5]，找到EFSP和DEFSJ对应的最小给药剂量（Dmin）值及最大给药剂量（Dmax）值。最后得到，EFSP的Dmin值为0.37 g/kg，Dmax值为6.00 g/kg；DEFSJ的Dmin值为1.88 g/kg，Dmax值为30.00 g/kg。

1.4.3 单次给药毒性正式实验分组及给药

按预实验结果，EFSP和DEFSJ的正式实验均分7个剂量组（空白组、枣汤组和5个药物组），每组12只，雌雄各半。空白组给予生理盐水，EFSP各剂量组依次为0.37、0.75、1.50、3.00、6.00 g/kg；DEFSJ各剂量组依次为1.88、3.75、7.50、15.00、30.00 g/kg；给药后连续观察14 d，其间记录各剂量组小鼠药后的毒性反应及死亡情况，对死亡小鼠及时尸检，并肉眼观察脏器的变化情况；同时于给药第4、9、14天测定各剂量组存活小鼠体重；实验结束后，处死取各剂量组存活小鼠，眼球取血，分离血清，上全自动生化分析仪测定相关生化指标；并取其组织（心、肝、脾、肺、肾）称重，脏器系数按照公式脏器质量（g）/体重（kg）计算；同时取各组小鼠的肝、肾组织，多聚甲醛固定后，HE染色，光镜下观察其组织病理学变化情况。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS 16.0软件统计，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，组间两两比较用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EFSP的单次给药毒性实验结果

2.1.1 给药后观察

小鼠接受单剂量EFSP后约30 min出现不同程度的中毒及死亡中毒小鼠主要表现为躁动后安静、而后出现抽搐、痉挛、呼吸急促等；给药后25 min开始出现死亡，动物死亡时间大多集中在药后6 h内，个别剂量组出现在2～3 d内。随着剂量的递减症状减轻，死亡率降低，各剂量组存活动物给药后第4天开始逐渐恢复，存活动物连续观察至药后14 d，动物一般状况较好，无明显异常。空白组及枣汤组小鼠活动自由，大小便正常，无任何中毒表现；对死亡小鼠进行大体解剖肉眼观察，个别小鼠肝脏呈现发黑，肾脏有肿胀的现象，其他脏器无明显变化。

2.1.2 对体重的影响

给药前各剂量组小鼠体重比较差异无统计学意义（P > 0.05）。给药后，与空白组比较，枣汤组在第4、14 天时体重升高，在第9天时体重降低，但差异无统计学意义（P > 0.05）；与枣汤组比较，EFSP 0.75 g/kg组在第4天时，及EFSP 1.50、3.00 g/kg组在第4、9、14天时体重均下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.1.3 对血液生化学的影响

与空白组比较，枣汤组AST、Cr值升高，差异有统计学意义（P < 0.05），ALT、BUN值升高，但差异无统计学意义（P > 0.05）；与枣汤组比较，EFSP 0.37、0.75、1.50、3.00 g/kg组ALT、AST、Cr、值及EFSP 1.50、3.00 g/kg组BUN值均升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

2.1.4 对脏器系数的影响

与枣汤组比较，EFSP 3.00 g/kg组的心、脾系数值增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.1.5 组织病理学HE染色检测结果

空白组与枣汤组，肝组织中肝窦数量多且清楚，肝小叶界限明显；EFSP 0.37 g/kg组，肝组织未见明显异常，EFSP 0.75、1.50、3.00 g/kg组小鼠肝脏均可见不同程度的肝小叶结构消失，界限模糊不清，肝细胞可见较多的颗粒变性，胞质疏松化，肝窦变窄，出现坏死灶。空白肾组织中肾小管排列整齐，肾小球清晰；EFSP 0.37、0.75 g/kg组肾组织未见明显异常，EFSP 1.50、3.00 g/kg组小鼠肾脏切片均可见肾小管上皮细胞呈现不同程度的水肿，部分肾小球体积增大，细胞数目增多。见图1。endprint

2.1.6 小鼠死亡情况及LD50、95%可信限

EFSP各剂量组的小鼠死亡分布见表4。

2.2 DEFSJ单次给药毒性实验结果

2.2.1 给药后观察

各剂量组给药后情况同“2.1.1”。

2.2.2 对体重的影响

给药前各剂量组小鼠体重比较差异无统计学意义（P > 0.05）。给药后，与空白组比较，枣汤组在4、9、14 d时体重升高，但差异无统计学意义（P > 0.05）；与枣汤组比较，DEFSJ 1.88 g/kg组在4 d时，DEFSJ 3.75 g/kg组在14 d时，DEFSJ 7.50 g/kg组在9、14 d时及DEFSJ 15.00 g/kg组在4、9、14 d时体重均下降，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表5。

2.2.3 对血液生化学影响

與空白组比较，枣汤组ALT、AST、Cr、BUN值升高，但差异无统计学意义（P > 0.05）；与枣汤组比较，DEFSJ 1.88、3.75、7.50、15.00 g/kg组ALT、AST、Cr值及DEFSJ 15.00 g/kg组BUN值均升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表6。

2.2.4 对脏器系数影响

与枣汤组比较，DEFSJ 7.50、15.00 g/kg组的心、脾系数及DEFSJ 15.00 g/kg组的肺系数值增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表7。

2.2.5 组织病理学HE染色检测结果

空白组与枣汤组的肝、肾组织病理学结果正常，DEFSJ 1.88、3.75 g/kg组肝组织未见明显异常，DEFSJ 1.88、3.75、7.50 g/kg组肾组织未见明显异常，DEFSJ 7.50、15.00 g/kg组肝组织及DEFSJ 15.00 g/kg组肾组织理学检测变化情况同“2.15”，结果同图1。

2.2.6 小鼠死亡情况及LD50、95%可信限

各剂量组的小鼠死亡分布见表8。

3 讨论

随着中草药的广泛应用，由于配伍不当或某些药物剂量过大等原因，中药的毒副作用也越来越引起大家的关注[6-8]。狼毒大戟性苦寒，有毒，为峻下逐水药，亦有保护肝细胞和促进肝功能恢复等多种药理功效[9-11]。临床上常配伍大枣使用治疗肝癌、乳腺癌等肿瘤性疾病，大枣甘缓和中，益气和胃，能减少脾胃对毒性药物的反应，使攻下而不伤正，能缓和狼毒大戟峻猛的药性，减其毒性[12-13]。也有文献报道，大枣味甘、性湿，功能补脾和胃，益气生津，滋心润肺，养血安神，悦颜色，通九窍，助十二经，和百药，久服轻身延年，与狼毒合用，强疗效，预防复发并缓解狼毒的毒性及对胃肠的刺激作用[14]；但其是否确能降低大戟科植物的毒性目前未能得到证实[15]。

目前，对狼毒大戟药材的研究多集中在化学成分的提取和分离，主要有二萜、三萜、鞣质、甾醇、蒽醌类等[16-19]。本研究所用药液为狼毒大戟原药磨成细粉与枣汤混合和狼毒大戟与大枣的水煎剂两种形式，来探讨狼毒大戟与大枣配伍使用的毒性大小；最终得到，EFSP的LD50为2.12 g/kg，95%可信限为1.61～2.78 g/kg；DEFSJ的LD50为12.60 g/kg，95%可信限为9.65～16.48 g/kg；狼毒大戟中萜类成分较多，二萜类化合物为主要活性成分[18]；萜类化合物主要存在于石油醚、乙酸乙酯等有机相提取物中，本研究中所用的DEFSJ为水煎剂，EFSP中的狼毒为原植物粉，故对比而言DEFSJ的毒性比EFSP小；而对于传统中药而言水煎剂使用更广泛，更具有实用意义，故本研究药液采用水煎剂形式。本研究中随着给药剂量的增加，小鼠体重变化较明显，由于体重变化的显著而多数脏器在给药后较短的时间内重量变化不太明显，导致小鼠的脏器系数出现无规律的变化；但病理学及生化学结果均证实两药有一定的肝、肾毒性。

综上所述，EFSP和DEFSJ两药均有一定毒性；本研究只起到为临床狼毒大戟的安全用药提供参考的作用，具体狼毒大戟与大枣配伍后是否真正达到减毒、强疗效的作用还有待进一步研究。

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（收稿日期：2017-10-05 本文编辑：张瑜杰）endprint