葛根素在脑缺血再灌注损伤时对局部肾素—血管紧张素系统的影响

2018-03-07 20:10王泽张永涛李珊
中国医药导报 2018年2期
关键词:肾素葛根素

王泽+张永涛+李珊

[摘要] 目的 探讨葛根素在脑缺血再灌注损伤(IRI)时对脑组织局部肾素-血管紧张素系统(RAS)的影响。 方法 选择Wistar大鼠60只,并按随机数字表法将其分为对照组(假手术)、模型组(线栓法成功制造大鼠脑IRI)和治疗组(线栓法成功制造大鼠脑IRI的同时给予葛根素进行干预);术后24 h处死实验动物,并采用Zea-Longa神经行为学评分评价大鼠的神经功能,HE染色观察大鼠脑组织的变性细胞指数(DCI),放射免疫法、Real-time PCR、Western blot检测大鼠脑组织RAS主要组分[血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素转化酶(ACE)、血管紧张素Ⅱ 1型和2型受体(AT1R和AT2R)]的表達。 结果 模型组和治疗组大鼠的神经行为学评分、DCI、AngⅡ、ACE、AT1R和AT2R均明显高于对照组(P < 0.05),当给予葛根素干预后,治疗组大鼠的神经行为学评分和DCI均较模型组下降(P < 0.05),同时伴随着脑组织局部RAS主要组分的下降(P < 0.05)。 结论 葛根素对大鼠脑IRI的保护作用可能与其抑制了脑组织局部RAS有关。

[关键词] 脑缺血再灌注损伤;葛根素;肾素-血管紧张素系统

[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2018)01(b)-0009-05

[Abstract] Objective To explore the effect of puerarin on the local cerebrum renin-angiotensin system (RAS) in cerebral ischemia reperfusion injury (IRI). Methods A total of 60 Wistar rats were selected and divided into the control group (sham operation), the model group (rats in the model group were established as cerebral IRI model by inserting a monofilament into middle cerebral artery) and the treatment group (rats in the treatment group were administered with puerarin after the cerebral IRI model was established) by random number table method. All rats were sacrificed 24 h after operation. The neurological function of rats was evaluated by Zea-Longa method. The denatured cell index (DCI) in cerebrum was observed by HE staining. Main components of renin-angiotensin system including angiotensinⅡ (AngⅡ), angiotensin converting enzyme (ACE), angiotensin type 1 receptors (AT1R) and angiotensin type 2 receptors (AT2R) were determined using radioimmunoassay, Real-time PCR and Western blot. Results The neurological function scores, DCI, AngⅡ, ACE, AT1R and AT2R in the model group and the treatment group rats increased significantly compared with those in the control group (P < 0.05). The neurological function scores and DCI after puerarin treatment were decreased significantly compared with those in the model group (P < 0.05), in the meantime, the main components of renin-angiotensin system were also inhibited by puerarin (P < 0.05). Conclusion The protective effect of puerarin on cerebral IRI in rats may have certain relationship to the inhibitory of the local RAS in cerebrum.

[Key words] Cerebral ischemia reperfusion injury; Puerarin; Renin-angiotensin system

葛根素是提取于豆科葛属植物野葛的干燥根中的异黄酮类化合物。研究表明葛根素对脑缺血再灌注损伤(IRI)具有很好的保护作用[1-4],但对于其作用机制并未完全阐明。组织局部肾素-血管紧张素系统(RAS)是近几年被人们发现的,与全身RAS具有相同组分,但相对独立的调控系统,同样包括血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素Ⅱ 1型和2型受体(AT1R和AT2R)和血管紧张素转化酶(ACE)[5]。研究表明葛根素对心肌局部RAS的抑制作用是其保护心肌损伤的主要机制之一[6]。而局部RAS同样存在于脑组织中,并且参与了脑IRI的发病过程[7]。但关于葛根素对脑IRI的保护作用是否与局部RAS有关,目前尚不十分清楚。本研究将利用大鼠脑IRI模型,通过分子生物学来验证葛根素对脑IRI的保护作用是否与局部RAS有关。endprint

1 材料与方法

1.1 动物模型与分组

选取8周龄雄性SPF级Wistar大鼠60只,体重200~250 g,购自青岛市药品检验所实验动物中心[SCXK(鲁)20100010]。将大鼠按照随机数字表法分为三组,即对照组、模型组和治疗组,每组20只。模型组采用线栓法[8]制造脑IRI模型,即缺血2 h/再灌注22 h模型,术后2 h采用Zea-Longa神经行为学评分法[9]对大鼠的神经功能进行评分,得分在1~3分之间代表模型成功,可将大鼠纳入后续研究,否则将大鼠剔除研究。在治疗组中,造模成功的同时按照100 mg/kg的剂量给予大鼠腹腔注射葛根素(山东方明药业股份有限公司,生产批号:1611187)。对照组未给予大脑中动脉栓塞。术后24 h再次给予大鼠神经行为学评分,然后处死。本研究通过青岛大学附属医院动物实验伦理委员批准。

1.2 HE染色

4%多聚甲醛固定大鼠脑组织,然后常规石蜡包埋,切片。将石蜡切片依次经二甲苯脱蜡,乙醇脱水,苏木精和伊红染色,并再次经乙醇脱水、二甲苯透明,最后用中性树胶固定封片。显微镜(Leica DMI4000B,德国)下对同一部位进行观察,并计算变性细胞指数(denatured cell index,DCI)。具体公式如下:DCI=变性细胞数/细胞总数。

1.3 AngⅡ浓度测定

将大鼠脑组织匀浆,并用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度,调整蛋白浓度一致。其余步骤按照AngⅡ放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所)说明书操作。每个样本设置3个复孔。

1.4 ACE活性测定

按上述方法提取大鼠脑组织蛋白,然后将蛋白匀浆与ACE的底物-马尿酸甘氨酰甘氨酸混匀,37℃水浴30 min,用乙酸乙酯提取混合液中的马尿酸成分,并用氯化钠充分溶解中,最后用紫外分光法测定混合液中马尿酸量,从而间接测定脑组织内ACE活性。其活性单位为每分钟nmol/mg蛋白。每个样本设置3个复孔。

1.5 Real-time PCR分析

RNA提取试剂盒(陕西先锋生物科技有限公司)提取组织内总RNA,反转录试剂盒(Fermentas,加拿大)将RNA反转录成cDNA。选用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂盒(Takara公司)于荧光定量PCR扩增仪(Bio-Rad,美国)进行扩增分析。具体引物序列见表1。每个样本设置3个复孔,并利用2-ΔΔCt的方法对目的基因的表达进行分析。

1.6 Western-blot分析

按上述方法提取大鼠脑组织蛋白,然后按常规方法依次进行蛋白变性、凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭,然后加入抗大鼠AT1R(Santa Cruz,美国)、AT2R(Abcam,美国)和ACE(Abcam,美国)抗体4℃过夜。第2天加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温下孵育2 h,然后显影。用GAPDH(Santa Cruz,美国)作为内参,采用Image Pro Plus 4.5圖像分析软件对蛋白表达进行半定量分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠神经行为学评分比较

术后2 h大鼠神经行为学评分发现,模型组12只大鼠造模成功[评分1~3分,平均(2.17±0.83)分],治疗组13只大鼠造模成功[评分1~3分,平均(2.23±0.83)分],差异无统计学意义(P > 0.05)。术后24 h大鼠神经行为学评分发现,治疗组大鼠的神经行为学评分[评分1~2分,平均(1.31±0.48)分]明显低于模型组[评分1~3分,平均(1.92±0.79)分],差异有统计学意义(P < 0.05)。对照组大鼠死亡2只,术后2 h和24 h评分均为0分。

2.2 大鼠脑组织病理学结果

HE染色结果显示,模型组大鼠脑组织内可见细胞排列紊乱,胞核固缩,细胞形态不完整;而治疗组大鼠脑组织区内病变细胞的数量明显低于模型组;对照组大鼠脑组织内细胞基本完整(图1)。通过对三组大鼠脑组织DCI比较发现,模型组和治疗组大鼠脑组织的DCI明显高于对照组(均P < 0.05);而治疗组大鼠脑组织的DCI较模型组明显降低(P < 0.05)(表2)。

2.3 大鼠脑组织AngⅡ浓度和ACE活性的比较

模型组和治疗组中大鼠脑组织AngⅡ浓度和ACE活性较对照组明显升高(均P < 0.05);治疗组大鼠脑组织中AngⅡ浓度和ACE活性较模型组明显下降(P < 0.05)(表3)。

2.4 大鼠脑组织ACE、AT1R和AT2R蛋白和mRNA水平的比较

模型组和治疗组大鼠脑组织ACE、AT1R和AT2R的蛋白和mRNA表达较对照组均明显升高(均P < 0.05);治疗组大鼠脑组织ACE、AT1R和AT2R的蛋白和mRNA表达较模型组均明显下降(均P < 0.05)(图2、表4~5)。

3 讨论

近年来,随着人们对RAS的研究,发现RAS不仅存在于全身内分泌循环系统,它也在于局部组织器官中,包括心脏、肾脏和肺脏等。存在于局部组织器官中的RAS,即为组织局部RAS。组织局部RAS是与全身RAS具有相同组分,但相对独立的调控系统,并且它在组织器官中发挥着特有的生物学作用[5]。

最近报道,脑组织中同样存在着局部RAS,并且参与了脑缺血性再灌注损伤的病理过程[10-13]。Nakagawa等[10]发现,过度激活RAS通过增加炎症因子和细胞凋亡,进而引起脑损伤。还有学者[11]发现,过度激活的RAS可通过氧化应激增加脑损伤,而AT1R阻断剂可以抑制氧化应激,进而保护脑组织。Zhang等[12]学者证实,激活的脑组织局部RAS可通过促进 C-JUN氨基末端激酶的表达,进而促进脑细胞凋亡,而AT1R阻断剂可以减少细胞凋亡,从而改善脑IRI。本研究发现模型组大鼠在发生脑IRI的同时,脑组织局部RAS的主要组分均明显升高。综上所述,目前的研究和本研究均表明,组织局部RAS不仅存在于脑组织中,而且在脑IRI中发挥重要作用。endprint

研究表明葛根素具有明显抑制RAS的作用[14]。吴黎明等[15]发现,葛根素通过NF-κB信号通路抑制心肌组织局部RAS的表达,进而保护心肌IRI。郭亚东等[16]发现,葛根素联合替米沙坦通过抑制RAS的过度激活,进而减轻肥胖和改善胰岛素抵抗。高静媛等[6]发现,葛根素通过抑制糖尿病大鼠RAS,进而发挥对心脏的保护作用。这些研究均已表明葛根素可以通过抑制组织局部RAS的激活,进而发挥其生物学疗效,而葛根素对脑IRI的保护作用已是不争的事实[1],其机制包括减轻兴奋性氨基酸毒性[17-18]、减轻炎性反应[19-20]、抑制细胞凋亡[21]和减轻脑水肿[4]等。但是,葛根素对脑组织局部RAS的抑制作用是否也是其保护脑组织的机制之一,目前尚不十分清楚。

本研究发现给予葛根素干预后,治疗组大鼠的脑IRI较模型组明显减轻,同时伴有脑组织局部RAS主要组分明显降低,这提示葛根素治疗大鼠脑IRI的作用可能与其抑制脑组织局部RAS有关,为葛根素治疗大鼠脑IRI提供了新的可能机制。

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(收稿日期:2017-10-04 本文編辑:张瑜杰)endprint

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