同型半胱氨酸对人主动脉平滑肌细胞ATP结合盒转运蛋白A1启动子甲基化水平及表达的影响

王慧媛+张紫荆+袁封艳

[摘要] 目的 探討同型半胱氨酸（Hcy）对人主动脉平滑肌细胞ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）启动子甲基化水平及表达的影响。 方法 培养人主动脉平滑肌细胞，将其分为两组：对照组和实验组。对照组不加Hcy，实验组加入不同浓度Hcy（50、100、200、500 μmol/L）培养48 h。闪烁计数法检测胆固醇流出率；实时定量PCR检测ABCA1 mRNA表达水平；Western-blotting检测ABCA1蛋白质表达；巢式甲基化PCR检测ABCA1启动子甲基化水平。 结果 对照组各时间点胆固醇流出率比较差异无统计学意义（P > 0.05）；各Hcy浓度组不同时间比较显示，24、48 h胆固醇流出率均明显低于0、12 h，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与对照组比较，0、12 h各Hcy浓度组胆固醇流出率差异无统计学意义（P > 0.05），24、48 h各Hcy浓度组胆固醇流出率显著降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与对照组比较，实验组ABCA1 mRNA相对表达水平下降（均P < 0.05），ABCA1蛋白质相对表达水平下降（P < 0.05），ABCA1启动子甲基化水平显著升高（P < 0.05）；不同Hcy浓度之间比较，ABCA1mRNA表达、ABCA1蛋白质表达和ABCA1启动子甲基化水平差异均无统计学意义（P > 0.05）。 结论 Hcy使人主动脉平滑肌细胞ABCA1启动子甲基化水平升高及表达下降，引起胆固醇流出率降低，可能是其引起动脉粥样硬化的病理机制之一。

[关键词] 同型半胱氨酸；ATP结合盒转运蛋白A1；甲基化；血管平滑肌细胞

[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（b）-0019-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of homocysteine （Hcy） on the promoter methylation and expression of ATP binding cassette transporter A1 （ABCA1） in human aortic smooth muscle cells. Methods The human aortic smooth muscle cells were divided into two groups： the control group and the experimental group. The cells in the control group were cultured without Hcy， however cells in the experimental group were cultured with different concentrations of Hcy （50， 100， 200， 500 μmol/L）. The cholesterol outflow rate was detected by scintillation counting technique， the expression of ABCA1 mRNA was detected by real-time quantitative PCR， the expression of ABCA1 protein was detected by Western-blotting， the ABCA1 promoter methylation was detected by nested detection of PCR. Results There was no significant difference in cholesterol efflux rate at each time point in the control group （P > 0.05）. Compared with Hcy treatment for 0 h and 12 h， after treatment of 24 h and 48 h the cholesterol efflux rate of the experimental were significantly decreased （P < 0.05）. After treated with Hcy for 0 h and 12 h， compared with the control group， there was no significant difference in cholesterol efflux rate （P > 0.05）. After treated with Hcy for 24 h and 48 h， compared with the control group， cholesterol efflux rate of the experimental group was significantly decreased （P < 0.05）. Compared with control group， ABCA1 mRNA relative expression level decreased （P < 0.05）， the relative expression level of ABCA1 protein was decreased （P < 0.05）， ABCA1 promoter methylation level was significantly increased （P < 0.05）. There was no significant difference in ABCA1mRNA expression， ABCA1 protein expression and ABCA1 promoter methylation level between different Hcy concentrations groups （P > 0.05）. Conclusion Hcy can increase the methylation level of ABCA1 promoter and decrease the expression of ABCA1 in aortic smooth muscle cells that lead to lower cholesterol efflux rate， which may be one of the pathological mechanisms of atherosclerosis.endprint

[Key words] Homocysteine； ATP binding cassette transporter A1； Methylation； Vascular smooth muscle cells

血管平滑肌细胞胆固醇流出减少转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化病理改变之一[1]。ATP结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporterA1，ABCAl）是介导胆固醇流出的限速因子，其功能下降会引起胆固醇流出障碍[2]。人类ABCAl基因启动子区DNA甲基化水平增高能够引起其表达及功能下降[3]。同型半胱氨酸（homocysteinemia，Hcy）是动脉粥样硬化的独立危险因素，其表观遗传机制越来越受到重视。Hcy增高会加速蛋氨酸循环，引起DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）增加，导致特定基因甲基化水平增高而影响其表达和功能[4]。已有研究表明，Hcy可以引起人单核源性泡沫细胞ABCA1基因甲基化水平上升[5]，导致胆固醇流出率下降，Hcy对人血管平滑肌细胞ABCA1基因启动子甲基化水平是否存在影响，目前尚无相关报道，对此本文进行探讨。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂

液体闪烁计数仪（美国PerkinElmer）；T/G HAVSMC细胞株（上海弘顺）；Hcy和[3H]胆固醇（美国Sigma）；ABCA1一抗（英国Abcam），β-actin一抗（北京中杉金桥），HRP二抗（1∶500，武汉博士德）；DNA甲基化修饰试剂盒（美国Epigenek）。

1.2 平滑肌细胞复苏、培养与分组

人主动脉平滑肌细胞株（T/G HAVSMC）细胞来自美国ATCC公司，复苏细胞株后培养，培养条件为：89%DMEM（高糖）+10%FBS+1%双抗，细胞密度达到80%以上进行1∶2或1∶3传代，2～3 d换液周期，取传3～4代后细胞进行实验，实验分为，①对照组：加入0 μmol/L Hcy；②实验组：加入不同浓度Hcy（50、100、200、500 μmol /L）培养，每组5瓶。

1.3 胆固醇流出实验

将加入不同浓度 Hcy培养T/G HAVSMC细胞至0、12 、24 h及48 h时间点，用0.2μCi/mL[3H]胆固醇在含有10%胎牛血清的DMEM培养液孵育48 h，待细胞長至85%时，用PBS液洗涤细胞2次，置含100 μg/mL的高密度脂蛋白的无血清DMEM培养基中孵育16 h，用闪烁计数法检测培养液和细胞中的[3H]胆固醇，胆固醇流出率=培养液中[3H]/总[3H]（培养液[3H]+细胞[3H]）×100%[6]。见图1。

1.4 ABCA1 mRNA表达水平检测

收集细胞，抽提总RNA逆转录合成cDNA，采用实时定量PCR法检测GAPDH、ABCA1 mRNA的含量，反应条件为：95℃预变性3 min后40次循环扩增（95℃ 10 s，58℃ 30 s，58℃ 30 s）。以GAPDH为内参，计算其相对表达量，数据采用2-ΔΔCt分析。引物序列如下：ABCA1：上游5′-GGGTGGTGTTCTTCCTCATTAC?TG-3′；下游5′-CCGCCTCACATCTTCATCTTCATC-3′；5′-AGCGTAGCGTTCTCATCC-3′；GAPDH上游5′-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′；下游5′-CGCT?CCTGGAAGATGGTGATGG-3′[7]。

1.5 ABCA1蛋白质表达水平检测

使用Western-blotting方法，提取T/G HAVSMC细胞总蛋白，4℃离心后取上清，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量后行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，加入 ABCA1一抗（1∶500）和β-actin（1∶1000）4℃孵育过夜，结合HRP二抗孵育1 h，加入ECL化学发光剂，暗室曝光、显影和定影。胶片扫描结果采用 Quantity-one软件分析，将目的条带与β-actin光密度值比较，所得比值表示蛋白相对含量。

1.6 ABCA1启动子甲基化水平检测

参照本课题组建立的方法[8]，使用巢式甲基化PCR检测，在线设计外引物（Out）、甲基化引物（M）和非甲基化引物（U）（见表1）。提取T/G HAVSMC细胞DNA，用重亚硫酸盐处理后进行2次PCR，取扩增产物琼脂糖凝胶电泳，采集图像Quantity-One软件分析，测量甲基化和非甲基化条带光密度值，二者比值反映甲基化水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆固醇流出实验

对照组各时间点间胆固醇流出率比较差异无统计学意义（P > 0.05）；各Hcy浓度组不同时间比较显示，24、48 h胆固醇流出率均明显低于0、12 h，差异有统计学意义（均P < 0.05）。与对照组比较，0、12 h各Hcy浓度组胆固醇流出率差异无统计学意义（均P > 0.05）；24、48 h各Hcy浓度组胆固醇流出率显著降低，差异有统计学意义（均P < 0.05）。双因素方差分析显示，Hcy对胆固醇流出率的影响差异有统计学意义（F=9.551，P < 0.01），时间对胆固醇流出率的影响具有统计学意义（F=3.447，P < 0.05），Hcy和时间对胆固醇流出率的交互影响差异无统计学意义（F=0.8179， P > 0.05。见表2。

2.2 ABCA1 mRNA和蛋白质表达以及启动子甲基化水平endprint

与对照组比较，不同浓度Hcy导致T/G HAVSMC细胞ABCA1 mRNA表达下降，差异有统计学意义（P < 0.05）（表3）；与对照组比较，不同浓度Hcy导致T/G HAVSMC细胞ABCA1蛋白质表达下降，差异有统计学意义（P < 0.05）（图2、表3）；与对照组比较，不同浓度Hcy导致T/G HAVSMC细胞ABCA1启动子甲基化水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）（图3、表3）。不同Hcy浓度之间比较，ABCA1 mRNA表达、ABCA1蛋白质表达和ABCA1启动子甲基化水平差异均无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

巨噬细胞和血管平滑肌细胞内胆固醇流出减少引起胆固醇沉积，转化成为泡沫细胞是动脉粥样硬化的发病机制之一[9]。研究表明，Hcy能够引起巨噬细胞胆固醇流出率下降[10-11]，然而Hcy能否导致血管平滑肌细胞胆固醇流出率改变，目前尚无相关报道。在本实验中，用不同浓度的Hcy处理平滑肌细胞24 h和48 h后，胆固醇流出率下降，双因素方差分析提示Hcy和时间对胆固醇流出率都具有影响，说明了Hcy能够降低血管平滑肌细胞胆固醇流出率。动脉粥样硬化病变部位的血管平滑肌细胞中ABCA1表达明显下降[11]，研究表明，ABCA1启动子甲基化水平增高可以导致其表达下降[2]。Hcy增高对于特定基因启动子甲基化的存在不同的影响[12]。在本实验中，在不同浓度Hcy的作用下，人主动脉平滑肌细胞ABCA1启动子甲基化水平显著升高，同时其mRNA和蛋白质表达均下降，可能的原因是Hcy增高会加速了蛋氨酸循环，引起DNMTs增加，DNMTs增高可以引起某些基因启动子区的高甲基化，从而引起基因沉默及表达下降[13]。

本实验研究结果还显示，用Hcy处理24 h和48 h后，100 μmol/L Hcy组胆固醇流出率最低，但差异无统计学意义，即Hcy的作用不具有剂量依赖性的。高浓度的Hcy的作用并未相应增强，其可能的原因是Hcy通过多种机制对血管平滑肌细胞产生影响，当浓度进一步升高后，其促进氧化应激、细胞凋亡、炎性反应等机制可能对细胞造成更严重的伤害，从而掩盖其对甲基化修饰的影响，与类似的研究结果相同[5，10]。

综上所述，Hcy可以导致人主动脉平滑肌细胞ABCA1启动子甲基化水平升高，引起其表达下降，造成胆固醇流出率的降低，可能是其引起AS的发病原因之一。目前针对巨噬细胞转化的研究较多，而对于血管平滑肌细胞研究较少，而血管平滑肌细胞的转化在AS的发病中具有重要的意义[12]，该研究深化了Hcy致动脉粥样硬化机制的认识，为寻找新的作用靶点提供有意义的实验依据。

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（收稿日期：2017-09-05 本文编辑：任 念）endprint