Tizanidine对胶质瘤细胞U251增殖、迁移及凋亡的影响

刘冰+霍会永+冯社军

[摘要] 目的 探究Tizanidine对胶质瘤细胞U251的增殖、迁移及凋亡的影响，并尝试探讨其作用机制。 方法 将U251细胞分为两组，一组用Tizanidine（20 μmol/L）处理24 h；另一组用DMSO处理为对照组。采用CCK8实验检测细胞增殖情况；采用Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭情况；采用细胞流式检测细胞凋亡情况，采用Western blot检测PI3K-AKT信号通路相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达量的变化。 结果 CCK8增殖实验表明Tizanidine可以抑制脑胶质瘤细胞U251的增殖（P < 0.05）；Transwell结果说明Tizanidine可以抑制脑胶质瘤细胞U251的迁移和侵袭（P < 0.05）；流式凋亡结果分析显示经无血清凋亡诱导后，经Tizanidine处理的细胞凋亡明显增多（P < 0.05），Western blot 结果显示经过Tizanidine处理的U251细胞，细胞的抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（BCL-2）的表达量显著下调（P < 0.05），促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（BAX）和Active Caspase3表达量则显著上调（P < 0.05），AKT和mTOR的磷酸化水平均受到了显著抑制（P < 0.05），PI3K/AKT信号通路的下游蛋白P70、CyclinD1的表达也相应下调（P < 0.05）。 结论 Tizanidine抑制胶质瘤细胞U251的增殖、迁移和侵袭，诱导其凋亡，这有可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路的激活实现的。

[关键词] Tizanidine；U251；PI3K/AKT信号通路

[中图分类号] Q71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（b）-0027-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Tizanidine on the proliferation， migration and apoptosis of U251， and to explore its mechanism， as well. Methods U251 cells were divided into two groups， one group treated with Tizanidine （20 μmol/L）， and the other treated with DMSO as control group. CCK8 assay was used to detect cell proliferation； Transwell assay was performed to detect cell migration and invasion； flow cytometry was adopted to detect cell apoptosis； Western blot was used to detect the expression of PI3K-AKT signaling-related proteins and apoptosis-related proteins. Results The proliferation of U251 cell was inhibited by Tizanidine （P < 0.05）； and Tizanidine treatment also inhibited migration and invasion of U251 cell （P < 0.05）； Tizanidine induced apoptosis in U251 cell （P < 0.05）； Western blot showed that the expression of Bcl-2 was significantly down-regulated （P < 0.05）， and the expression of BAX and Active Caspase3 were both significantly up-regulated in Tizanidine-treated U251 cells （P < 0.05）， respectively. In addition， Tizanidine significantly inhibited the phosphorylation levels of AKT and mTOR （P < 0.05）， and the expression of related downstream proteins （P70s6k and Cyclin D1） were decreased in U251 cells （P < 0.05）. Conclusion Tizanidine inhibits proliferation， migration and invasion， induces apoptosis in U251 cell， which may be achieved by inhibiting activation of the PI3K/AKT signaling pathway.

[Key words] Tizanidine； U251； PI3K/AKT signaling

腦胶质细胞瘤，即脑胶质瘤，是人脑肿瘤中所占比例最大并且发病率也相对较高的一类肿瘤，它的发病率约占颅内肿瘤的46%，综合发病年龄有两个高峰期，分别集中在30～40岁和10～20岁。由于胶质瘤具有发病率高且易复发的特点[1]，且胶质瘤具有很强的侵袭性和迁移能力，导致临床上通过手术切除联合放疗和化疗的传统疗法难以有效治疗胶质瘤[2-3]。因此，探索和研究大脑中脑胶质瘤的发生以及转移的新的分子机制并找出其转移的有效靶点，对于治疗脑胶质细胞瘤有重要的临床借鉴意义。Tizanidine是一种α2-肾上腺素能受体激动剂，能够抑制中枢神经系统（central nervous system，CNS）去甲肾上腺素能神经元释放神经递质，临床上常作为肌肉松弛剂，用于治疗由脊髓或中枢神经系统等多种硬化症，肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、痉挛性瘫痪、背部疼痛或某些其他损伤引起的肌肉痉挛、痉挛和紧张。也是一种辅助睡眠的抗惊厥药[4-5]。本研究主要用Tizanidine治疗胶质瘤，检测其能否有效抑制胶质瘤细胞U251的增殖，并尝试阐述Tizanidine影响细胞增殖、凋亡的具体机制。endprint

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

胶质瘤细胞U251细胞株购于中国上海中科院细胞库；Tizanidine购于美国MCE公司；RPMI-1640培养液购自美国Hyclone公司；血清购自美国的Gibco公司；双抗购于美国SIGMA公司；0.25%胰酶消化液（EDTA）、CCK8-kit购于北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购于美国AMRESCO公司；RIPA蛋白裂解液、RIPA Lysis Buffer、BCA蛋白定量试剂盒、BCA Protein Assay Kit、蛋白酶抑制剂混合物Protease Inhibitor Cocktail购于北京康为世纪生物科技有限公司（CWBIO）；蛋白上样缓冲液，LDS Sample buffer购于美国Invitrogen公司；蛋白预染Marker购自美国Thermo公司；ECL显影液、一抗（bcl-2、bax、active-caspase3、CyclinD-1、P-70、tubulin）、HRP標记的羊抗兔/羊抗鼠二抗购于美国PTG公司；一抗（AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR）购于CST公司；TRANSWELL小室购于美国Millipore公司；Matrigel基质胶购于美国BD公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 细胞培养和分组

使用DMEM培养液（含10%血清，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL链霉素）于37℃，5%CO2环境下对U251细胞进行常规培养，对数生长期进行传代处理。孔板中的细胞密度达80%左右时，Tizanidine（20 μmol/L）处理24 h，对照组（NC）加DMSO（1∶1000），其他处理条件与实验组一致。

1.3 CCK8检测Tizanidine对脑胶质瘤细胞U251增殖的影响

用胰蛋白酶对贴壁的U251细胞消化离心后，制备细胞悬液，计数。根据计数结果，取适量细胞悬液，以100 μL/孔（约1000个细胞的标准）种进96孔板，对照组和Tizanidine组分别加入千分之一的DMSO和20 μmol/L的Tizanidine，将细胞放于CO2培养箱（37℃，5%CO2）中常规培养。每隔24 h每孔加10 μL CCK8试剂，37℃培养箱中孵育1.5 h，检测细胞活力，并用酶标仪在450 nm激发光下检测OD值，绘制胶质瘤细胞U251的增殖曲线。

1.4 Transwell迁移和侵袭实验检测Tizanidine对胶质瘤细胞U251迁移和侵袭的影响

将提前过夜融解的Matrigel基质胶100 μL（无血清培养液按1：6稀释）加入到24孔板的transwell小室的上室中，晃匀后置于37℃ CO2培养箱中静置4～6 h成胶，后吸干培养液，下室中加500 μL不含血清的培养液，静置半小时水化基底膜。用无血清培养液将加药处理了24 h的细胞制备成细胞悬液，细胞计数后取约100 μL细胞悬液（1×105个）加入到上室中，同时在下室中加入500 μL完全培养液。过夜处理后，取出小室，擦掉上室中残余的细胞，用PBS清洗后，用4%多聚甲醛进行固定，时间为30 min。之后，用0.1%结晶紫进行染色，时间为20 min，再用PBS清洗，显微镜下随机选取5个视野拍照观察并计数。

迁移实验步骤类似于侵袭实验，Transwell小室无须进行铺胶处理，细胞数目将为5000个。

1.5 Annexin V/FITC检测Tizanidine对胶质瘤细胞U251凋亡的影响

细胞加药处理24 h后，将培养液换成无血清培养液，常规条件下培养饥饿24 h。收集细胞：用不含EDTA的胰酶将细胞消化后收集到离心管中，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入4℃预冷的PBS重悬细胞并再次离心，小心吸出上清。加入1×结合缓冲液将细胞重悬，细胞计数，将细胞密度调节为1×106～5×106/mL。取5 mL的流式管加入100 μL细胞悬液，再加入5 μL Annexin V/FITC，混匀，室温下避光孵育5 min。再加入10 μL PI染液，同时加400 μL PBS，之后进行上机检测。用Flowjo软件对流式结果进行分析处理。

1.6 Western blot检测细胞增殖、迁移、凋亡相关蛋白的表达

将对照组和Tizanidine组加药处理24 h，之后将六孔板置于冰上，加入300 μL/孔的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）裂解20 min，提取蛋白于1.5 mL EP管内，BCA法测定蛋白浓度，95℃加热5 min。垂直电泳槽内每孔内加入约20 μg蛋白。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对离蛋白样品进行分离，转膜，裁膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜。次日，取出条带，用TBST于摇床上洗3次，每次5 min，之后对条带二抗室温孵育1 h，洗膜，加ECL显影。Quantity One软件扫描灰度值，以GAPDH为内参对照，用目的蛋白与内参的比值计算各蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Tizanidine对胶质瘤细胞U251增殖的影响

CCK8增殖实验结果表明，经过Tizanidine处理48 h和72 h的U251细胞增殖能力受到显著抑制，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 Tizanidine对胶质瘤细胞U251迁移和侵袭的影响

Transwell实验结果表明，Tizanidine处理的U251细胞侵袭能力受到显著抑制[（35±4）个比（17±2）个]，差异有统计学意义（t=6.97，P < 0.05）；迁移能力也同样受到抑制[（113±5）比（75±3）个]，差异有统计学意义（t=11.29，P < 0.05）。见图2。endprint

2.3 Tizanidine对胶质瘤细胞U251凋亡的影响

流式凋亡结果分析表明：经无血清凋亡诱导后，Tizanidine处理组细胞凋亡明显增多[（11.87±0.27）%比（4.15±0.31）%，t=32.53，P < 0.05]，见图3。抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）表达量显著下降[（0.598±0.095）比（1.00±0.180），t=3.421，P < 0.05]，促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-Associated X protein，BAX）表达量上调[（1.990±0.150）比（1.00±0.124），t=8.811，P < 0.05]，Active Caspase3表达量同样显著上调[（1.477±0.079）比（1.00±0.126），t=5.555，P < 0.05]。见图4。

2.4 Tizanidine对胶质瘤细胞U251中PI3K/AKT信號通路的影响

Western blot结果表明经过Tizanidine处理的U251细胞，AKT和mTOR的磷酸化水平均受到了显著抑制[（0.627±0.102）比（1.000±0.201），t=2.87，P < 0.05；（0.491±0.130）比（1.000±0.282），t=2.84，P < 0.05]。PI3K/AKT信号通路的下游蛋白p70核糖体蛋白S6 激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70s6k/P70）和G1/S-特异性周期蛋白-D1（CyclinD1）的表达也同样被抑制[（0.537±0.074）比（1.000±0.314），t=2.79，P < 0.05；（0.417±0.084）比（1.000±0.197），t=4.72，P < 0.05]。见图5。

3 讨论

胶质瘤，即脑神经胶质瘤，是临床上比较常见的一种颅内肿瘤，由于其无法控制的细胞增殖以及肿瘤侵袭性等生物学行为，导致胶质细胞瘤的治疗面临严峻挑战[6]。U251细胞是目前已经建立的比较经典的一类人的恶性胶质瘤细胞株，现作为神经胶质瘤的细胞模型已经被广泛用于科研工作中。

Tizanidine是一种α2-肾上腺素能激动剂，可以激活α2-肾上腺受体，进而对天冬氨酸和谷氨酸或者P物质的释放产生抑制作用[7]。此外，它还能激活第二信使，抑制腺苷酸环化酶活性，降低细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，同时激活细胞钾离子通道，引起细胞膜的超极化，对钙离子内流产生抑制，引发下游效应。为探究Tizanidine在胶质细胞瘤中的作用，本研究选用Tizanidine处理U251细胞并检测细胞增殖和凋亡情况。实验结果显示Tizanidine可以显著抑制U251细胞的增殖，增加细胞凋亡，抑制肿瘤的进展。

磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路由Ras、PTEN、PIP、PI3K、AKT等多种蛋白组成。PI3K/AKT信号通路在细胞的增殖、生长以及存活等生命活动中发挥着重要作用，并发现其在多种癌症中过表达[8-11]。磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（phosphotidylinositol 3，4，5-trisphosph?ate，PIP3）是磷脂酰肌醇的肌醇环上的3'-OH磷酸化了的一类酶，包括Ⅰ、Ⅱ类和Ⅲ类[12]。它是由PI3K产生的一种十分重要的脂质第二信使，并能够通过多种信号转导途径激活丝氨酸/苏氨酸激酶（phosphoin?ositide dependent kinase-1，PDK1）和AKT[13-14]。AKT，也就是我们通常所说的蛋白激酶B，可以通过磷酸化mTOR来控制蛋白质的合成和细胞的生长[15-16]。研究表明，PI3K/AKT信号通路的激活会导致肿瘤细胞的增殖失去控制，进而引发肿瘤的侵袭与转移[17]。近年来有研究显示，IA型PI3K及其下游分子AKT所组成的PI3K/AKT信号通路在人类肿瘤的生物学特性中十分重要[18]。PI3K/AKT信号通路可以调节肿瘤细胞的增殖和存活，能够引发肿瘤细胞代谢活动异常，从而导致细胞的恶性转化，并且该信号通路与肿瘤的迁移、增殖、黏附等密切相关[19-20]。本研究发现Tizanidine处理可以减少胶质瘤细胞U251中PI3K/AKT通路的激活以及其下游相关蛋白P70和CyclinD1的表达，提示Tizanidine可能是通过PI3K/AKT通路产生抑癌作用。以上结果提示Tizanidine或许能够给胶质细胞瘤的治疗提供新的药物靶点，其具体机制仍待进一步研究。

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（收稿日期：2017-08-24 本文编辑：任 念）endprint