P16蛋白表达在分流宫颈上皮内瘤变Ⅱ中的临床意义

黄丽萍+林霞

[摘要] 目的 觀察不同宫颈病变患者组织中p16蛋白的表达，探讨p16蛋白作为CINⅡ分流参考指标的可行性。 方法 选取2013年1月～2015年8月于南方医科大学附属中山博爱医院行阴道镜下活检病理证实为子宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌四组标本各170例，进行p16免疫组化染色，观察各组不同宫颈病变中p16表达情况，统计p16蛋白检测在诊断宫颈上皮内瘤样病变2级及以上（简称CINⅡ+，包括CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌）中的效能。并对确诊的170例CINⅡ患者进行每6个月1次的随访直至确诊后2年，随访异常患者则行阴道镜下活检，分析p16蛋白表达情况与患者CINⅡ级病变转归结局的关系。 结果 ①宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ及宫颈癌组p16蛋白阳性率分别为3.53%、41.18%、81.18%、100%，总体差异有统计学意义（P < 0.05）；CINⅡ组p16蛋白阳性率显著高于宫颈炎组、CINⅠ，差异有统计学意义（P < 0.01），CINⅢ与宫颈癌组p16蛋白阳性率显著高于CINⅡ、CINⅠ、宫颈炎组，差异有统计学意义（P < 0.01）。②p16蛋白检测CINⅡ+的灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值和阴性预测值分别是90.59%、77.65%、84.12%、80.21%、89.19%。③138例p16蛋白表达阳性的CINⅡ随访异常患者中62例（44.93%）病变进展，32例p16蛋白表达阴性的CINⅡ随访异常患者中3例（9.38%）病变进展，两者比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 随着宫颈病变程度的加重，p16蛋白阳性率不断增加。p16蛋白检测在发现CINⅡ+的病变中具有较好的灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值和阴性预测值。p16蛋白表达情况可预测CINⅡ疾病进展情况，临床上可应用于CINⅡ的分流。

[关键词] 宫颈上皮内瘤样病变；细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p16蛋白；子宫颈癌；高度鳞状上皮内病；低度上皮内病变

[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（b）-0083-05

[Abstract] Objective To observe the expression of p16 protein in the tissues of patients with different cervical lesions， and to investigate the feasibility of p16 protein as a reference index of CIN Ⅱ. Methods From January 2013 to August 2015， 170 cases underwent colposcopy and biopsy in Zhongshan BOAI Hospital Affiliated to Southern Medical University proved cervicitis， CIN Ⅰ and CIN Ⅱ， CIN Ⅲ and four cervical carcinoma group were selected， the expression of p16 were observed in different cervical lesions by p16 immunohistochemical staining， efficiency of the test of p16 protein in the diagnosis of CIN Ⅱ and above statistic （CINⅡ+， including CIN Ⅱ， CIN Ⅲ and cervical cancer） performance. And 170 cases of CIN Ⅱ patients were followed up every six months until 2 years after diagnosis with abnormal colposcopic biopsy， the relationship between the expression of p16 and outcome measures of CIN Ⅱ patients lesions was analyzed. Results ①The p16 positive rates of the cervicitis group and CIN Ⅰ group and CIN Ⅱ group， CIN Ⅲ and cervical cancer groups were 3.53%， 41.18%， 81.18%， 100% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）； the positive rate of p16 protein in the CINⅡ group was significantly higher than that of cervicitis group and CIN Ⅰ group， the differences were statistically significant （P < 0.01）， the positive rate of p16 protein in the CIN Ⅲ group and cervical cancer group were significantly higher than CINⅡ group， CINⅠgroup， cervicitis group， the differences were statistically significant （P < 0.01）. ②The sensitivity， specificity， coincidence rate， positive predictive value and negative predictive value of p16 protein in the detection of CINⅡ+ were respectively 90.59%， 77.65%， 84.12%， 80.21% respectively， 89.19%. ③62 cases （44.93%） in 138 CIN Ⅱ patients with positive expression of p16 protein had abnormal follow-up， 3 cases （9.38%） of 32 cases of disease progression CIN Ⅱ patients with negative expression of p16 protein had abnormal follow-up， the difference of two were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The positive rate of p16 protein increased with the severity of cervical lesions. Detection of p16 protein shows better sensitivity， specificity， coincidence rate， positive predictive value and negative predictive value in the detection of CINⅡ+. The expression of p16 protein can predict the progression of CIN Ⅱ disease， and can be applied to the shunt of CIN Ⅱ in clinic.endprint

[Key words] Cervical intraepithelial neoplasia； Cyclin-dependent kinase inhibitor p16 ；Cervical cancer； High-grade squamous intraepithelial lesion， HSIL； Low-grade squamous intraepithelial lesion

宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是宫颈癌发生前的病变，目前，常用的CIN诊断方法苏木精-伊红染色法（HE）法，该法受人为主观因素影响较大，在CINⅡ诊断中尤为突出。因此，使用生物学标志物为CIN的诊断提供客观依据显得特别重要。

p16蛋白是抑制蛋白，具有抑制细胞增殖、调节细胞周期的作用[1]。2012年美国病理学会（CAP）和美国阴道镜与宫颈病理学会（ASCCP）推荐p16蛋白作为CIN病变诊断的生物标志物，其免疫组化染色可以很好地用于评估高级别上皮内瘤变[2]。郭宇雯等[3]研究表明p16可为早期子宫颈癌的病理诊断提供实验依据。那么，p16蛋白在不同宫颈病变中的阳性率差异是如何的？p16蛋白检测发现CINⅡ+的效能是如何的？p16蛋白能否为临床医生处理CINⅡ提供实验依据？这一系列疑问非常值得我们进一步深入探讨。

本研究通过分析在南方医科大学附属中山博爱医院（以下简称“我院”）行阴道镜下活检病理证实为子宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌四组标本各170例，进行p16免疫组化染色，分析各组不同宫颈病变中p16表达情况及p16发现CINⅡ+的的效能。并对确诊的170例CINⅡ级患者进行每6个月1次的随访直至确诊后2年，随访异常患者则行阴道镜下活检，分析p16蛋白表达情况与患者病变转归结局的关系，探讨能否应用p16作为CINⅡ分流的参考指标，从而为临床处理提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年1月～2015年8月于我院行阴道镜下活检680例宫颈组织标本，患者年龄22～79岁，平均年龄（49.6±9.8）岁；其中宫颈炎性患者、CINⅠ级患者、CINⅡ级患者、CINⅢ及宫颈癌患者各170例；纳入宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌病变患者。患者未接受相关手术、药物、物理治疗；无合并其他恶性疾病；无自身免疫疾病；未服用免疫抑制药物；非妊娠期、非月经期。

1.2 试剂与设备

3ML LED光学电子阴道镜为德国莱斯康公司生产，SAKURA Tissue Tek Vip-5全自动密闭式组织脱水机、DRS-2000J-D2全自动染色机均为日本樱花检验仪器株式会社生产。Thermo HM325轮转石蜡切片机为德国Thermo生产，切片厚度2～3 μm。Bench Mark XT自动免疫组化染色机由美国Ventana公司生产。DM3000生物显微镜由德国徕卡公司生产。抗p16（E6H4，规格：50测试/盒）鼠单克隆抗体试剂及免疫组化检测试剂盒购自美国Ventana Medical Systems公司。

1.3 组织标本采集、制片及HE染色

阴道镜下取宫颈活体组织标本，经4%中性缓冲甲醛固定，二甲苯透明，酒精脱水、浸蜡等程序按中华医学会病理学会病理技术相关规程进行[4]，包埋，2～3 μm厚切片，裱片于防脱片载玻片上。HE染色程序如下：切片分别经二甲苯脱蜡，酒精脱水，苏木精染色，盐酸酒精分化，氨水返蓝，HE染色，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 p16蛋白检测

烘干的切片在Bench Mark XT自动免疫组化染色机进行染色，中性树胶封固。每次染色均以PBS代替一抗作阴性对照，用已知的宫颈癌p16蛋白阳性标本作阳性对照。实验过程严格按照厂家的试剂、仪器说明书执行操作。p16蛋白判读参考探针试剂盒说明和相关文献[2]。染色结果分为3种模式：鳞状上皮的基底和基底旁细胞层出现连续性棕黄色着色，呈弥漫阳性（>25%）判定为阳性，点状、灶状着色呈局灶阳性（≤25%）或无着色判定为阴性[5-6]。本研究中将组织病理学结果为CINⅡ+定为阳性。

1.5 随访内容

对2013年1月～2015年8月我院确诊的170例CINⅡ级患者进行每6个月1次的随访直至确诊后2年，随访内容：包括妇科检查、TCT检查、高危型HPV检查（HC2法）、阴道镜检查，如有异常则行阴道镜下活检。病变转归：转归结果分为消退、持续和病变进展3个标准，以未发现CIN病变为消退，以持续CINⅡ病变为持续，以发现病变CINⅢ及其以上为进展。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，比较四组宫颈疾病的p16蛋白阳性率的总体差異检验标准取α=0.05，四组不同子宫颈病变的两组组间进行比较时检验标准取α′=0.008（0.05/6）。

2 结果

2.1 不同子宫颈病变组织HE染色及对应的p16蛋白染色阳性图像

宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ及宫颈癌组患者HE染色图像及对应的p16蛋白染色阳性图像见图1（封三）。HE染色显示：慢性子宫颈炎组织上皮细胞呈慢性炎改变；子宫颈CINⅠ组织上皮异型细胞局限于上皮层的下1/3区；子宫颈CINⅡ组织上皮异型细胞占上皮层的1/3～2/3；子宫颈CINⅢ组织上皮异型细胞超过上皮层的2/3但还未累及上皮全层；子宫颈癌组织上皮异型细胞累及上皮全层。p16蛋白染色：p16蛋白阳性部分从上皮层的顶部逐渐累及上皮全层。

2.2 四组不同子宫颈病变患者p16蛋白阳性率的比较endprint

宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ及宫颈癌组患者p16蛋白阳性率见表1，总体差异有统计学意义（χ2=191.633，P < 0.05）；CINⅡ组p16蛋白阳性率显著高于宫颈炎组、CINⅠ，差异有统计学意义（均P < 0.01），CINⅢ与宫颈癌组p16蛋白阳性率显著高于CINⅡ、CINⅠ、宫颈炎组，差异有统计学意义（P < 0.01）。提示p16蛋白随着宫颈病变程度的加重，阳性率不断增加。

2.3 p16蛋白检出CINⅡ+病变情况

将组织病理诊断结果为CINⅡ+定为金标准的阳性患者，p16蛋白检测结果为阳性与金标准进行比较，p16蛋白发现CINⅡ+病变的灵敏度、特异度、符合率、阳性预测值和阴性预测值分别是90.59%（308/340）、77.65%（267/340）、84.12%（572/680）、80.21%（308/384）、89.19%（264/296）。提示p16蛋白检测具有良好的发现CINⅡ+的效能。见表2。

2.4 不同p16蛋白表达情况的CINⅡ患者病变进展

138例p16蛋白表达阳性的CINⅡ级随访异常患者中62例（44.93%）病变进展，32例p16蛋白表达阴性的CINⅡ级随访异常患者中3例（9.38%）病变进展，p16蛋白表达阳性的CINⅡ级患者病变进展率是p16蛋白表达阴性的4.79倍，两者比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

宫颈上皮内瘤变是宫颈癌发展过程中的癌前期病变，及时发现癌前病变并给予合适的治疗是预防宫颈癌发生、降低宫颈癌死亡率的重要手段。2012年ASCCP关于下生殖道鳞状上皮病变项目（LAST project）建议，用“病变（lesion）”取代了“肿瘤（neoplasia）”[7]，2014年出版的《WHO女性生殖器官肿瘤学分类（第4版）》将宫颈病变分为低度鳞状上皮内病变及高度鳞状上皮内病变[8]。

目前，在大部分文献中仍沿用CIN的说法。根据美国国立综合癌症网络（NCCN）宫颈癌筛查指南，CINⅠ患者主要临床处理为随访观察，CINⅡ/Ⅲ治疗主要为子宫颈锥切术。但研究[9]显示，CINⅡ的生物学行为更接近CINⅠ，最终发展成宫颈浸润癌的只有不到5%。因此，如果对所有的CINⅡ患者进行手术治疗则会导致一定程度的过度治疗。因此临床迫切需要简便、有效的检测手段以协助医生对患者进行分流，以减少过度治疗或延误诊治的发生。p16基因位于人类染色体9P21，该蛋白通过抑制CDK4的活性，从而阻止Rb蛋白的磷酸化，最终使细胞停滞于G0期或G1期，而抑制细胞分裂、增殖[10]。

本研究结果可见，宫颈炎组、CINⅠ组、CINⅡ组、CINⅢ及宫颈癌组患者p16阳性率，总体差异有具有统计学意义（χ2=191.633，P < 0.05）；CINⅡ组p16蛋白阳性率显著高于宫颈炎组、CINⅠ，差异有统计学意义（P < 0.01），CINⅢ及宫颈癌组阳性率为100%，提示p16蛋白随着宫颈病变程度的加重，阳性率不断增加。

本次研究中，笔者将组织病理诊断结果CINⅡ+定为金标准的阳性患者，p16蛋白检测结果为阳性的患者与金标准进行比较。p16蛋白发现CINⅡ以上病变的特异度、灵敏度、符合率、阳性预测值和阴性预测值分别是90.59%、77.65%、84.12%、80.21%、89.19%，提示p16蛋白检测具有良好的发现CINⅡ+的效能。

在证实了上述两观点的基础上，本研究进一步对确诊的170例CINⅡ级患者进行每6个月1次的随访直至确诊后2年，随访异常患者则行阴道镜下活检，分析了p16蛋白表达情况与患者CINⅡ级病变转归结局的关系，从本研究检测的p16蛋白表达与CINⅡ疾病进展情况来分析，p16蛋白表达阳性的CINⅡ级患者病变进展率是p16蛋白表达阴性的4.79倍。因此，本研究认为p16蛋白检测可在临床上可应用于CINⅡ的分流。有研究证实p16蛋白检测在CINⅠ具有很好的分流作用[11-16]，相關研究也发现p16/Ki67双染检测在意义不明的不典型鳞状细胞具有分流诊断中的作用[17-23]。而本研究应用p16蛋白检测针对临床迫切需要而病理容易误诊的CINⅡ级大样本病例进行探讨，旨在寻求一种简便、有效的检测手段有助于预测CINⅡ患者的预后检测指标，可以真正意义上对患者进行个体化治疗，也能更好地管理随访这部分患者，从而降低宫颈癌的发生率。因此，p16检测具有重要的临床意义。

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（收稿日期：2017-10-23 本文编辑：任 念）endprint